Фото биозавивка мосса: Химическая завивка Mossa, фото и отзывы о процедуре

Содержание

Химическая завивка Mossa, фото и отзывы о процедуре


Биологическая завивка Mossa в салоне красоты Bonita.pro – это инновационный подход к созданию роскошных кудрей на волосах любого типа и степени поврежденности.


В состав большинства растворов, используемых для завивки волос входит тиогликолевая кислота, которая отлично держит укладку. Однако на этом ее достоинства заканчиваются и начинаются недостатки: неприятный запах во время процедуры, сохраняющийся даже после смывания раствора, негативное влияние на сами волосы и вполне вероятные аллергичекие реакции – все это поджидает женщину во время проведения химической завивки. Каждая, кто хоть раз прошел через эту процедуру, хорошо знаком с такими «приятными» последствиями, как ломкость и выпадение волос, тусклость  цвета и ненатуральность прически.


Однако теперь, дорогие женщины, Вы можете стать обладательницами завораживающе прекрасных кудрей, сохранив при этом здоровье и красоту нежно любимых волос. Наш салон красоты представляет Биологическую завивку Mossa от известного итальянского бренда Green Light — состав, в котором отсутствуют тиогликолевая кислота и ее производные, столь негативно влияющие на волосы и кожу головы. Входящие в состав раствора экстракт бамбука, протеины и витамины помогают поддержать здоровье волос во время процедуры биозавивки и обеспечивают превосходный результат.


Несмотря на мягкий состав, не травмирующий волосы, завивка получается очень стойкой и держится от трех месяцев до полугода,сходит мягко и не оставляет ярковыраженной демаркационной линии при отрастании волос. Различные составы позволяют создать кудри на тонких и нормальных волосах, а также в случае необходимости исправить ошибки, допущенные при завивке с использованием химических средств.


Благодаря столь мягкому воздействию на волосы, биозавивку можно сочетать с процедурами окрашивания или мелирования волос. Она не влияет на яркость и насыщенность цвета, волосы остаются мягкими и изумительно приятными на ощупь. Мастера салона прошли соответствующие обучение Green Light и имеют все необходимые сертификаты. 


С биологической завивкой Mossa Ваша мечта о красивых локонах станет реальностью!

Биозавивка волос и ошибки, которые я совершала.

Сегодня я расскажу о том, что бывает с волосами после 7-ой по счету биозавивки, каких ошибок можно было избежать, на своем примере покажу, как выглядят волосы через месяц, через три месяца, через полгода и через год.

Несколько лет назад я уже писала статью о биозавивке на длинные волосы, где отвечала на самые популярные вопросы из сети. С тех времен мои волосы значительно изменились (стали короче и слабее), а вопросов от желающих сделать биозавивку прибавилось. Поэтому буду рассказывать и показывать одновременно.

В 7-ую мою биозавивку я очень «удачно» и последовательно совершила ряд стратегических ошибок, которых можно было бы избежать при здравых размышлениях. Но этого не случилось, поэтому мне будет о чем поведать.

Как и предыдущие 6 раз, я делала биозавивку Mossa от итальянского бренда Green Light, у того же самого мастера, в том же самом салоне Maramax в Одессе.

Пришла я на процедуру с довольно короткими (для меня) волосами и невнятной стрижкой. Так как смотреть в зеркало на себя я просто физически уже не могла, то выбрала знакомый путь — сделаю биозавивку, так легче отращивать волосы. Так, действительно, легче пережить невнятную длину и дорастить локоны ниже плечей.

В течении полугода до похода на 7-ую биозавивку я пережила 5-ую и 6-ую. Почему я сделала, по сути, 3 биозавивки подряд за полгода? Зачем, и в своем ли я уме? Правильные вопросы — и вот моя первая ошибка.

ОШИБКА №1. Неправильный выбор размера коклюшек.

Крупного размера коклюшки дают крупные красивые локоны без эффекта негритянской мамы Чоли. Но! На моих густых, плотных и тяжелых волосах они совершенно не держатся — завиток начинает распрямляться уже через месяц. Так как я хотела себе получить легкую волну, то выбрала крупные коклюшки, мотивируя мастера тем, что я сама все знаю, опытный боец, все будет, как надо. Все было, как надо. Целый месяц. Потом было просто никак. Окей, подумала я, так просто мы не сдадимся — и сделала еще одну биозавивку. На крупные и средние коклюшки. Эффект продержался чуть дольше. Несколько месяцев, спустя которые моя голова выглядела так:

Можно возразить (и такие возражения уже звучали в мой адрес в интернете), мол, Юля, нормальные «живые» на вид волосы, надо просто уложить их красиво и немного потерпеть. Ну что сказать: я объективно выглядела плохо с этой кипой торчащих в разные стороны волос совершенно-не-моей-длины. Лет на 10 старше своего возраста. И не то, чтобы умнее. А еще, основной объем моей шевелюры сосредоточился в районе ушей, что мало того, что выглядело странно, так еще и искажало пропорции моего лица.

Если бы не острое желание быть кому-то полезной этой статьей, я бы ни за что не показала эти фотографии. Я бы их удалила со всех носителей, сменила бы пароли и эккаунты в соцсетях. Но, раз уж назвался блогером…

В общем, пришла я в салон с такими вот волосами:

В этот раз мы с мастером Натальей выбрали мелкие коклюшки. Я отдавала себе отчет, что в первый месяц буду напоминать лохматого пуделя, но с распущенными волосами ходить не планировала, а в легкой небрежной прическе мелкие кудряшки можно пережить. Через месяц, думала я, локон оттянется, и я буду видеть в зеркале привычную красавицу. Ха!

Но вернемся к биозавивке. Напомню, что процедура занимает примерно полтора часа (это у опытного мастера, у неопытного — растягивается на 4 часа) и включает в себя: мытье головы «предзавивочным» шампунем, накручивание волос на коклюшки, последовательное нанесение 2-ух составов на волосы с интервалом в 30-40 минут, мытье и сушка волос.

Ничего необычного в этой процедуре нет, поэтому не вижу смысла останавливаться на ней подробно. После того, как меня освободили от коклюшек (и мои глаза перестали разъезжаться к вискам от натяжения волос), я увидела в зеркале вот такую кудрявую копну:

Здесь мне нравится результат, потому что я вижу, что локоны завились равномерно, волосы выглядят здоровыми, завиток тугой и упругий.

Довольная собой и жизнью я отправилась домой (чтобы не мыть и не расчесывать волосы двое суток), выслушав при этом в очередной раз наставления от Натальи, которая мне напомнила о необходимости специального ухода и моделирующей стрижки. Вообще, я все это и сама знала, понимала, что ухаживать за биозавитыми волосами нужно чуть более тщательно и бережно, но закрутилась, завертелась, поэтому никаких наставлений не выполнила.

И недели через 3-4 после биозавивки отправилась с друзьями на пикник, где и было сделано вот это фото:

О боги! Мои волосы стали выглядеть как пук сухой травы! Где мои красивые локоны? Где мои здоровые волосы? Почему вьются только концы, и куда делся прикорневой объем? Отсюда мы плавно переходим к двум последующим моим ошибкам.

ОШИБКА №2. Отсутствие структурной стрижки после биозавивки.

Не надо так. И прошу вас — не пренебрегайте этим советом, стрижка — самый эффективный способ получить красивые завитушки после биозавивки.

Примерно через неделю после биозавивки нужно посетить парикмахера, чтобы он придал прическе форму, состриг суховатые кончики и правильно простриг локоны. Как правило, волосам с биозавивкой не идут ровные срезы волос. Чтобы получить задорную копну, пряди волос должны быть разной длины. После посещения парикмахера моя голова стала выглядеть на порядок лучше. Помимо стрижки я еще осветлила концы и сделала растяжку цвета по длине в модной технике шатуш-балаяж-омбре-чего-то там. И как видите, волосы снова начали виться по всей длине, перестав ассоциироваться с паклей.

В тот же период я постаралась исправить свою третью ошибку, и мне это удалось.

ОШИБКА №3. Отсутствие специального ухода за волосами после биозавивки.

По-хорошему, нужно было не жадничать, а купить прямо в салоне рекомендованный профессиональный уход за кудрявыми волосами. Но моя жаба сказала тогда свое веское «давай в следующий раз»,  а потом как-то не было то оказии, то финансов. Тем не менее, я перешла на более щадящие шампуни доступных марок (это были Фаберлик и Натура Сиберика), стала использовать увлажняющие и питательные маски и бальзамы для волос. Перестала сушить волосы феном, налегала на чистую воду и морскую рыбу. Пропила витамины для волос. И волосы пошли в активный рост, чтобы через 2 месяца выглядеть вот так:

Это был уже достаточный прогресс, потому что завиток был именно такой, как мне надо: упругий и держащий форму. Правда, окрашенные волосы выглядели не очень хорошо, так как осветленные части ушли в рыжину, но на тот момент я этого не осознавала. Было лето, волосы красиво развевались по ветру, блестели на солнышке и не доставляли мне особых хлопот.

Затем наступила осень, но моя шевелюра кардинально не изменилась: волосы слегка отросли, но все так же развевались на ветру 🙂

Затем пришла зима — и я стала замечать очевидный переход между отросшими своими волосами и биозавитыми кончиками. Не то чтобы это было критично, ведь одновременно с отрастанием корней происходило распрямление локона, но было некое перераспределение объема опять ближе к ушам. Зато меня радовал тот факт, что я потихоньку состригала осветленные концы, которые уже надоели мне хуже пареной редьки.

Завиток по-прежнему оставался красивым и плотным.

Но я поняла еще одну свою ошибку.

ОШИБКА №4. Неудачный цвет волос.

Кудряшки любят сложные окрашивания, переливы цвета и глянцевый блеск. Кудряшки не любят ржавых, тусклых, блеклых оттенков. Лично на мой вкус, кудряшки хорошо выглядят с холодными оттенками волос и не очень — с теплыми. Особенно, с искусственно теплыми. Ярко-рыжие — да, бледно-желтые — нет.

Пережив зиму в шапке и успешно сняв ее весной, я поняла две вещи: нужно менять стрижку (потому что мне дико надоел срез полукругом, он к тому моменту лишь акцентировал внимание на переходе от прямых волос к локонам) и нужно избавляться от вылинявшего цвета на кончиках волос.

Так как я дико соскучилась по своему родному каштановому цвету волос, я решила вернуться к нему. Путем некоторых ухищрений со стороны колориста мы вышли на единый по всей длине коричневый оттенок, с холодным подтоном.

Как видно по фото, спустя год после биозавивки локоны значительно распрямились, но не исчезли полностью. Это произошло из-за того, что я делала биозавивку на мелкие коклюшки (и регулярно поддерживала завиток стрижками). От крупных коклюшек на моих волосах через год уже не осталось бы и намека.

В анфас волосы смотрятся довольно прилично, слегка небрежно, но мне по душе такой эффект.

На всех фото волосы не расчесаны и никак не уложены специально. То самое «проснулась и пошла», о котором многие мечтают. Я люблю эффект «пляжных локонов» и всю эту рок-эн-рольность на волосах. А вот девушкам, которые любят аккуратные, волосок к волоску, укладки, с биозавивкой придется несладко.

Стоит честно признать тот факт, что волосы не всегда выглядят одинаково. В один день завиточки как по команде лежат красиво и аккуратно, в другой — прическа похожа на парик для образа городской сумасшедшей. Иногда я мою голову и наслаждаюсь готовой стильной укладкой без фена и стайлеров, а иногда такого не случается, и я «наслаждаюсь» вариациями прически на тему «дулька обыкновенная». Биозавивка — это не панацея и не вещь в себе. Это просто один из вариантов структуры волос, который кому-то подходит, а кому-то — нет. Мне — подходит. Мне нравится небрежность, необременительность, торчащие волоски и глобальный переполох на голове. И он мне идет, если уж об этом речь. Поэтому я и сделала 7 биозавивок. Но я вовсе не уверена, что в ближайшее время сделаю восьмую. Но если сделаю — обязательно покажу 🙂


Основные ответы на вопросы о том, портит ли биозавивка волосы, в каких случаях она противопоказана, сколько держится и как правильно выбрать мастера-парикмахера, уже написаны и содержатся в моей первой статье на эту тему: «Биозавивка волос в вопросах и ответах на личном примере«.


Тема биозавивки — очень популярна, и, вполне возможно, я не раскрыла до конца все тонкости и нюансы. Задавайте вопросы в комментариях, а я на всякий случай буду обдумывать третью часть этой саги 🙂


P.S. Если вы хотите быть в курсе наших новостей, добавляйтесь в Facebook, ВКонтакте, в Instagram, в Twitter или в ЖЖ.

Также, удобно следить за нами с помощью приложений для чтения блогов, например, Bloglovin или Feedly.

 

Похожие записи

Юлия Зенченко

Идейная лентяйка — любит придумывать всякое, а реализуют пусть другие. В крайних случаях отдумывает все обратно. В душе этой брюнетки с трудом уживаются вместе честность и фантазии, цинизм и наивность, страсть к бьюти-экспериментам и пофигизм.

особенности биохимии на густые и тонкие волосы с челкой и без. Как сделать крупные локоны? Уход после процедуры

Химическая завивка волос

В стремлении сделать шевелюру объемной и вьющейся женщины прибегают к разным салонным процедурам, включая такой современный вариант, как биозавивка. Особенностью данной техники работы с локонами является тот факт, что ее можно удачно осуществить даже на коротких волосах. В результате этого короткую женскую стрижку удастся преобразить и украсить кудрявыми локонами разного размера и формы.

Что это такое?

Еще не так давно обладательницам коротких женских стрижек сложно было представить, что на подобную длину получится сделать красивые кудри, поскольку результатом всех экспериментов, проводимых ранее при помощи домашних и салонных процедур, было появление малопривлекательных завитков, которые неаккуратно торчали в разные стороны. На сегодняшний момент ситуация с возможностями, позволяющими обрести красивые вьющиеся локоны при помощи новых технологий завивки, имеет положительную тенденцию.

Сегодня для женщин с короткими волосами мастера предлагают биохимическую завивку – процедуру, в основе которой лежит использование для фиксации локонов максимально природных компонентов, на долю которых приходится порядка 70% от общего количества ингредиентов.

Воспользовавшись этой услугой, можно обрести привлекательную прическу, которая потребует минимум усилий для ежедневной укладки, а стрижка сохранит свою свежесть и красивый внешний вид минимум на 3-4 месяца. Как показывает практика, после биохимии на короткие волосы женщины приобретают более динамичный и яркий образ, кроме того, прическа становится романтичнее и женственнее.

Суть завивки заключается в накручивании локонов на специальные коклюшки либо бигуди с использованием фиксирующих составов щадящего действия.

Кроме того, возможности биозавивки на короткие волосы позволяют подлечить очень тонкие и ослабленные волосяные стержни, подпитывая локоны по всей длине, включая кончики и корни.

Все препараты, используемые для биозавивки, выпускаются на основе цистиамина. Он представляет собой канцерогенный протеин, имеющий довольно специфический запах, который на некоторое время может сохраняться на кудрявых локонах. Цистиамин является аналогом цистина, полученный искусственным путем, поэтому его контакт с волосом не оказывает губительного воздействия на шевелюру, наоборот, способствует появлению после завивки дополнительного объема и блеска.

Кроме базовой составляющей, препараты для биохимической завивки обогащаются комплексными лечебными добавками, которые положительно сказываются на внешнем виде и структуре волосяных стержней. В свете появления такой услуги для преображения женских волос стандартная и довольно агрессивная химическая завивка стала использоваться женщинами в разы меньше вследствие большого количества негативных последствий, которые она оказывает на локоны в сравнении с биохимией.

Чаще всего биохимическая процедура для легких коротких стрижек проводится при помощи бигуди маленького диаметра и размера, благодаря которым удается придать прически воздушность и пышность. Однако мастер может предложить клиентке довольно оригинальный вариант создания укладки, когда в процессе завивки будут использоваться коклюшки разного размера в определенном чередовании, что позволит придать образу оригинальный внешний вид. Как правило, более крупные приспособления для получения кудрей на коротких волосах используются в прикорневой зоне.

Разновидности

Сегодня для женских стрижек с небольшой длиной волос применяются несколько разновидностей биохимической завивки.

Шелковая волна

Довольно популярный современный вариант биохимии, отличительной чертой которого является включение в фиксирующий состав микрочастиц шелка. Процедура носит универсальный характер, поэтому может быть использована на натуральных либо окрашенных локонах, на густых волосах с челкой, а также ломких и ослабленных волосяных стержнях. Среди противопоказаний следует выделить лишь те локоны, которые были окрашены натуральными красящими пигментами, например, хной либо басмой. В результате такого варианта биохимии кудри становятся очень мягкими и живыми. Как правило, эффект красивых завитков сохраняется на протяжении 2-3 месяцев.

Нейтральная завивка

Этот вид завивки рекомендуют для создания кудряшек на плотных волосяных стержнях, которые будут выделяться своей жесткостью. Особенностью используемых препаратов в данном случае является наличие такого компонента, как бетаин и кератин, которые обеспечивают локонам активное увлажнение и питание для более привлекательного внешнего вида завивки. Как правило, созданные кудри выпрямляются постепенно и довольно равномерно, поэтому эффект от биохимии при должном уходе удастся сохранить на протяжении полугода.

Mossa

Идеальный вариант для коротких стрижек. В результате подобной процедуры клиентка получит некрупные локоны, которые могут довольно неудачно смотреться на каре или каскаде, а, наоборот, мелкие завитки, которые получится уложить в очень красивый и женственный образ.

В составе используемых продуктов для фиксации итальянской завивки присутствует большое количество витаминов и протеинов, поэтому биохимия не имеет противопоказаний к применению даже на слишком ослабленных и поврежденных волосяных стержнях. Препараты для завивки никак не отражаются на исходном цвете волос женщины, завитки раскручиваются поступательно, поэтому четкой границы между отросшими прядями и завитыми, как правило, не наблюдается.

Результат подобной биохимической завивки будет радовать представительницу прекрасного пола не менее 6 месяцев.

Однако биохимия имеет некоторые ограничения и противопоказания:

  • от завивки следует временно воздержаться в период беременности и кормления ребенка грудью;
  • перед процедурой следует в обязательном порядке сделать тест на аллергию, поскольку даже натуральные компоненты могут спровоцировать подобную реакцию организма;
  • биозавивку не рекомендуется делать при приеме гормональных средств, а также во время менструации, когда гормональный фон будет нестабильным;
  • биохимическую завивку нельзя проводить сразу после окрашивания волос;
  • противопоказанием к процедуре являются заболевания кожных покровов на голове, а также раны и ссадины.

Для создания красивых завитков на коротких волосах обычно используется всего два размера бигуди. Для получения эффектной укладки длина волос должна быть не менее 5 сантиметров, для локонов с меньшей длиной мастер может подобрать приспособления для завивки совсем маленького размера.

Преимущества и недостатки

Современный щадящий вариант завивки обладает рядом положительных особенностей, которые обуславливают популярность услуги. Можно выделить несколько основных достоинств биозавивки.

  • В первую очередь положительные характеристики подобной временной завивки обусловлены ее минимальным ущербом для волосяных стержней. В сравнении с обычной химической процедурой либо ежедневными укладками при помощи плоек или утюжков волосы от биозавивки портятся значительно меньше.
  • В отличие от домашних укладок, единожды выполнив биохимию, можно получить красивые вьющиеся локоны на срок до полугода.
  • Для процедуры подходят и натуральные, и окрашенные волосы.
  • Для коротких стрижек актуальным преимуществом окажется возможность преобразить свою прическу и образ в целом. А в случае с минимальной длиной это бывает довольно проблематично.
  • Обладательницам тонких волос биохимия даст возможность получить на голове столь желаемый объем и пышность.
  • В результате таких экспериментов с волосами женщин старшего поколения можно визуально омолодить их на несколько лет.
  • После процедуры кудрявые локоны становятся блестящими и шелковистыми на ощупь. Обусловлено это наличием в составе используемых препаратов натуральных компонентов, которые благотворно воздействуют на здоровье и внешний вид волос.
  • Биозавивка не ограничивает женщину в плане проведения коррекции цвета корневой зоны и покраски в целом. С течением времени при необходимости можно подкрасить прикорневую зону базовым цветом либо же перекрасить волосы полностью.
  • По мере надобности кудри удастся выпрямить при помощи обычного утюжка для волос.
  • Перед биозавивкой на короткие волосы необязательно отправляться в салон для создания свежей стрижки. Вьющие локоны подчеркнут форму уже имеющейся прически.

Однако не лишена техника завивки прядей и некоторых минусов:

  • сразу после завивки и спустя несколько дней волосы будут сохранять специфический аромат химических составляющих, используемых в препаратах;
  • в условиях салонов красоты биозавивка может быть дорогостоящей;
  • после завивки локоны будут нуждаться в специальных средствах по уходу, что повлечет за собой дополнительные траты;
  • несмотря на преимущественную натуральность состава, завивка все же оказывает негативное влияние на структуру волосяных стержней.

Способы проведения

Безусловно, качественный и просто красивый результат после завивки можно получить в ходе работы с волосами профессионального мастера. Как правило, вся процедура получения кудрявых локонов состоит из нескольких этапов.

  • Сначала мастер выполняет осмотр и оценку состояния волосяных стержней – с учетом исходной длины и здоровья волос он подберет наиболее подходящий препарат для работы. Выбранный состав тестируется на предмет аллергической реакции организма.
  • Следующим шагом является мытье головы. Для этих целей рекомендовано применять специальную продукцию, обладающую глубоким действием. Это необходимо для того, чтобы кутикула волоса смогла максимально раскрыться и впитать в себя используемый препарат для фиксации.
  • Затем наступает черед разбора волос на несколько зон с выделением и накручиванием локонов на выбранные бигуди. После этого накрученные пряди обрабатываются цистиамином и оставляют на четверть часа для получения реакции. За это время белок проникнет вглубь волосяного стержня, изменяя его структуру и замещая собой некоторые имеющиеся протеины.
  • По прошествии времени мастер смывает препарат с волос, при этом коклюшки должны оставаться на голове. Удаляется средство при помощи большого количества воды. Затем на кудри наносится фиксатор, благодаря которому удается достичь закрытия кутикулы волосяного стержня и восстановления щелочного баланса внутри волоса.

А также выполнить биохимическую завивку вполне возможно самостоятельно дома. В этом случае удастся сэкономить время и средства. С короткими волосами можно справиться в одиночку либо с одной помощницей.

Алгоритм работ в данном случае сводится к выполнению ряда последовательных действий.

  • Сначала стоит правильно подобрать диаметр и количество коклюшек для завивки. В данном случае все будет зависеть от личных предпочтений. Для работ понадобится купить состав для фиксации, а также позаботиться о защитных средствах, таких как перчатки, накидка и шапочка для волос.
  • До нанесения препарата, как и в случае с салонной процедурой, сначала нужно сделать аллерготест. Перед завивкой следует вымыть голову, разделить еще влажные локоны на несколько участков. Начать накрутку прядей на коклюшки нужно с темени, двигаясь к затылку, в последнюю очередь накручиваются боковые пряди. Закручивая волосы на бигуди, нужно следить за тем, чтобы они располагались по отношению к голове под прямым углом.
  • В таком виде необходимо нанести на локоны состав для завивки. Для удобства использования производители выпускают препараты для завивки в специальных флаконах с носиками. Чтобы равномерно распределить вещество по волосам, можно воспользоваться небольшой губкой. Держать средство на голове необходимо согласно инструкции.
  • Затем его смывают, не снимая бигуди, наносят нейтрализатор на 10 минут.
  • После чего пряди промываются, коклюшки снимаются, прическа дополнительно увлажняется бальзамом.

Как сделать биозавивку на короткие волосы, смотрите в следующем видео.

Способы укладки

Укладывать короткие волосы после биозавивки можно несколькими способами.

Классический вариант

Идея быстрой повседневной укладки предполагает нанесение на волосы пенки либо другого фиксирующего состава. После этого волосы следует высушить, приподнимая пряди в области корней, немного сминая локоны руками. При необходимости укладку можно зафиксировать лаком.

Эффект мокрых волос

Легкий и летний вариант укладки, которую можно выполнить дома при помощи геля либо мусса. В данном случае использовать фен необходимости нет, достаточно будет обработать кудри составом и дождаться их полного высыхания.

Для того чтобы определиться с наиболее выигрышным способом укладки, стоит поэкспериментировать с разными вариантами, учитывая, что завитки сами по себе выглядят очень красиво и самобытно.

Уход после процедуры

После процедуры биозавивки стоит временно воздержаться от таких мероприятий:

  • нельзя мыть голову после химии в течение 2-3 дней для закрепления эффекта;
  • стоит отказаться на время от использования фена, утюжков и средств для стайлинга;
  • не стоит сразу же красить волосы.

Для продолжительного эффекта от биозавивки стоит выполнять рекомендации специалистов по уходу.

  • Мыть кудрявые локоны правильнее будет специализированными составами. Лучше всего приобрести сразу целый набор уходовой косметики, состоящий из шампуня, бальзама и маски.
  • Использование магазинных либо домашних питательных масок для кудрявых волос является обязательным. Процедуры по восстановлению и увлажнению стоит выполнять еженедельно. Среди эффективных и полезных веществ стоит выделить масла, средства на основе желтков, лука либо дрожжей.
  • После мытья кудрявые локоны нельзя расчесывать сразу, волосы должны просохнуть. Правильнее дать шевелюре просохнуть естественным образом, но если необходимо ускорить высыхание, можно использовать фен с режимом подачи холодного воздуха. Расческа для ухода должна быть мягкой с редко расположенными зубчиками.
  • Краску после завивки нужно использовать из безаммиачной серии.
  • Стоит раз в 3 месяца состригать концы.
  • Завивка продержится дольше, если не использовать для мытья локонов вертикальный душ.

Биозавивка волос в Москве,без вреда для волос — Сеть салонов красоты Naturel Studio

Дорогие дамы! Собираясь посетить наш салон впервые, каждую из вас посещают сомнения:
Буду ли я довольна результатом?
А поймёт ли меня мастер?
Получится ли цвет как на фотографии?
Мы решили ответить на эти вопросы за вас и дать ГАРАНТИЮ на результат окрашивания. В течение десяти дней мы перекрасим вас абсолютно бесплатно, если результат окрашивания не будет соответствовать заявленному.

Услуга биозавивки волос в салоне красоты «Naturel Studio» выделена в особую категорию любимых клиентами и исполнителями процедур. Мы подготовили материал, раскрывающий основные принципы безвредного создания завитков, который поможет читателю найти ответы на вопросы: стоит ли делать биозавивку, какой из многочисленных вариантов выбрать и самое главное – где и кому доверить свои драгоценные волосы, чтобы избежать разочарования.

БИОзавивка

Биохимическая завивка волос – таково полное название технологии, моментально вытеснившей привычный перманент из списка популярных процедур для быстрого преображения. Так почему же способ, имеющий в своем названии слово «химия», характеризуется как натуральный, можно сказать, почти природный метод завивки локонов?
Весь секрет кроется в применении различных средств.
    •    Химия использует такие вредные для шевелюры компоненты, как пероксид водорода, аммиак и тиогликолевую кислоту.
    •    БИО-метод построен на использовании полезного завивающего ингредиента – гидрохлорида цистеамина. Несмотря на пугающее химическое название, этот компонент является аналогом аминокислоты цистеина – ведущего компонента в строительстве белка человеческого волоса.
Вот так сложно, но, если разобраться детально, то вполне просто различаются два направления салонных услуг для завивки любого типа волос.

Наше видео биозавивка на бумеранги

Достоинства биозавивки

Помимо своего максимально приближенного к природе действия, биозавивка имеет дополнительные плюсы:
    •    тонкие и безжизненные волосы обретут силу и объем
    •    скудные пряди получат столь необходимую пышность
    •    жирные волосы на продолжительное время станут нормальными, и частота мытья волос сократиться как минимум вдвое
    •    ежедневная укладка из часового ритуала превратиться в приятную пятиминутку: отпадет необходимость использования фена, плойки и утюжка, а для стайлинга понадобится минимум средств и манипуляций.
Стоит ли упоминать, что биозавивка буквально преображает леди, добавляет ей шарма, женственности и элегантности. Ухоженный вид навевает мысли о богемности натуры, а роскошное изящество идет впереди своей обладательницы, открывая перед ней самые прекрасные перспективы.

Наше видео биозавивки волос «Спираль»

Процедура биозавивки

Посмотреть, как проходит сеанс в одном из наших салонов красоты в Москве, вы можете на данном видео.
Несмотря на разнообразие биозавивок, процедура проводится примерно по одному сценарию:
    •    Первый шаг – это предварительная консультация. Напомним, что ни один уважающий себя мастер не приступит к завивке без продолжительной личной беседы с клиентом. В этом разговоре решаются не только вопросы выбора формы завитка и типа процедуры, но тщательно изучаются сами волосы и здоровье их обладательницы, исключаются или выявляются противопоказания, подбирается оптимальный метод и средство для биозавивки.
    •    Далее, в зависимости от выбранной технологии, проводится ритуал безопасной завивки. Принимая выбранную форму, завиток напитывается аминокислотой, которая в дальнейшем поддержит здоровье волос и придаст им жизненную силу и блеск.
    •    Смывка закрепляющего завитки средства обычно проводится с использованием различных полезных для волос средств, призванных закрыть чешуйки волоса и защитить прическу от вредного воздействия окружающей среды.
    •    Последним этапом является профессиональная укладка, позволяющая клиенту получить советы от мастера по возможностям стайлинга своей новой прически.

Если вам хочется только больше прикорневого объема без укладки! Посмотрите видео о процедуре BOUFFANT

Более подробно о BOUFFANT Вы можете узнать тут

Виды завитков

Сегодня в арсенале мастера есть все инструменты для создания самых невероятных локонов, представленных на страницах глянцевых журналов – от легких естественных волн до африканской завивки.
Крутость завитка напрямую зависит от твердости и диаметра аксессуара, использованного в процедуре:
    •    для легкого эффекта вьющихся волос используются крупные мягкие стайлеры и твисты;
    •    для более выраженных кудрей подбираются средние бигуди и бумеранги;
    •    африканка создается на мелких жестких коклюшках.

Мягкие крупные локоны

Сейчас данный вид завитков можно назвать самым востребованным. Натуральность снова вошла в моду, и мы создаем по-настоящему шикарные мягкие крупные локоны, используя бумеранги и твисты, придающие нотку хаоса образу, и организующие прическу мягкие бигуди.

Ухоженная естественность – цель, достичь которую способен только мастер высочайшего класса

Как выбрать идеальный завиток

Каждая леди в воображении примеряет на себя понравившийся образ из журнала или фото в Интернете. В мире грез любые разновидности завивки идеально подходят к внешности, характеру и настроению мечтательницы. Однако реальность вносит свои коррективы, и зачастую приходится принимать во внимание такие факторы, как здоровье и тип волос, физические параметры и законы, овал лица и вид прически.
Не стоит заморачиваться на сопоставление всех этих факторов самостоятельно. Такая задача по плечу только действительно опытному мастеру. Перечислим лишь некоторые рекомендации, которые помогут до консультации со специалистом подсказать верное направление в выборе образа:
    •    Чем мягче волос, тем более он подвержен действию закона всемирного тяготения: самые задорные кудряшки под его напором раскручиваются, оставляя на прическе вместо упругих пружинок лишь легкую волну. Однако применение крутого завитка поможет перехитрить этот физический параметр и создать нежный кучерявый образ на весьма мягкой шевелюре.
    •    Крупные завитки способны держаться только на нормальных и толстых волосах: в идеале это жесткие азиатские шевелюры.  
    •    Уменьшение длины волос и добавление стрижке многоуровневой структуры увеличивают шансы на обретение долгоиграющих крепких локонов.

Стрижка до или после биозавивки

Леди, хоть раз в жизни проходившие процедуру химической завивки, наверняка вспомнят, что придание прическе формы происходило после процедуры накручивания. Это было обусловлено повреждающим эффектом перманента на кончики волос. Такой подход также был целесообразен потому, что завиток получался действительно крутым и крепким и вытягивание при стрижке не приводило к его деформации.
Новые технологии диктуют свои правила: сегодня порядок действий противоположен ранее установленному – стрижка производится до сеанса биозавивки. И для этого есть минимум три причины:
    •    качество прически и точность формы в таком случае будут лучше;
    •    новые завитки нуждаются в некоторой заботе и покое – не стоит их беспокоить в первые дни после процедуры;
    •    бережный биосостав не только не портит волосы, но и укрепляет их, поэтому кончики волос остаются целыми, особенно после стрижки горячими ножницами.

Стрижка горячими ножницами наше видео

Биозавивка на разной длине волос

Для самых решительных перемена образа может включать не только биозавивку, но и более кардинальное изменение длины волос. Благо, сегодня есть множество вариантов не только с укорачиванием, но и с удлинением прически.

Биозавивка на длинные волосы

Коса до пояса – это достижение. Особенно когда вся эта копна здоровая и сияющая. Но и она начинает со временем вызывать желание что-то усовершенствовать, поменять. Как насчет биозавивки?
    •    Да! Если вы готовы несколько подкорректировать форму прически, сделав ее более удобной для завивки: лесенка не будет скрадывать красоту ваших волос, но позволит раскрыть весь потенциал завитушек по всей длине. Градуировка, выполненная во время стрижки, высвобождает кончики наружу, и это способствует наилучшему подчеркиванию формы прически при помощи завитков.
    •    Да! Если это будет креативная или локальная биозавивка, которая выделит лучшее в существующем образе и скроет недостатки шевелюры или формы.
    •    Нет! Если вы хотите завить всю копну равномерно. И дело не в принципах, а в эффекте:  под действием закона всемирного тяготения произойдет естественное распрямление от корней к центру. Останется неравномерная волна.  И ситуацию не спасут завитки на кончиках. Поверьте, это смотрится совсем не симпатично.
Стоит отметить, что, несмотря на типичность процедуры завивки на длинные волосы, все же от мастера требуется максимум энергии и опыта для создания действительно классного результата. Поэтому сеанс биозавивки на роскошной копне длится гораздо дольше и под силу далеко не каждому специалисту парикмахерского дела.

Биозавивка на средние волосы

Средняя длина прически – это бескрайний полигон испытаний любой фантазии на тему биозавивки. Уже не раз упомянутый закон всемирного тяготения хоть и не исключается в данном случае, но и не диктует свои условия с той же силой, как на длинных волосах.
Конечно, профессиональная многоуровневая стрижка придаст завиткам наибольший шик и завершенность, поэтому совет насчет предварительного изменения формы и характера прически остается в силе для волос средней длины. Особенно он касается густых шевелюр, которые без предварительной градуировки будут выглядеть грубо и тяжеловесно в обрамлении завитушками.

Биозавивка на короткие волосы

Динамичность коротких стрижек принимает разное настроение в зависимости от выбранного размера и локации локонов. Предпочтение сегодня отдается локальной и креативной биозавивкам, хотя и сплошные завитки на мастерски исполненном каре будут смотреться ничуть не хуже.

Особенности биозавивки

Безусловно, не только стрижка, длина и тип волос влияют на внешний вид и длительность эксплуатации биозавивки. Мастер всегда учитывает все факторы, способные снизить качество и сократить срок службы завитков.

Биозавивка на натуральные волосы

Это лучший вариант, когда прическа не перегружена краской, кератином и не ослаблена химической завивкой. Работать с такими волосами, особенно если они не имеют ярко выраженных проблем – одно удовольствие.

Завивка на обесцвеченные волосы

Несмотря на многочисленные достижения в индустрии красоты, обесцвечивание остается наносящей вред здоровью волос процедурой. Конечно же, есть и исключения, например, окрашивание CHI, но, как показывает практика, в наш салон часто обращаются леди с замученными осветлением безжизненными шевелюрами. Пытаясь хоть как-то вернуть беспомощным волосам жизнь, они надеются на чудо в виде биозавивки.
Если случай не самый запущенный, то мы беремся за восстановление шевелюры, применяя для создания завитков самые щадящие составы, однако в большинстве случаев требуется дополнительный уход и восстановление волос.

Только мастер может вынести окончательное решение о возможности биозавивки на обесцвеченных волосах

Биозавивка на окрашенные волосы

Несмотря на сочетаемость многих видов биозавивки с окрашиванием, есть несколько правил, которые мы рекомендуем соблюдать:
    •    Не стоит применять биозавивку на свежеокрашенные волосы. Раствор для завитушек может видоизменить изначальный цвет.
    •    Хна и басма на волосах, скорее всего, не позволят биозавивке добиться хороших результатов: локоны могут не получиться совсем или часть из них окажутся деформированными. Бывает и стопроцентный успех, но процедура достаточно дорогая, чтобы идти на риск. Мы рекомендуем отрастить длину без натурального красителя и после стрижки, удаляющей окрашенные хной кончики волос, приступить к биозавивке.

Здесь вы можете выбрать себе одного из наших мастеров по их личным страничкам, где находится множество фото их работ, а также видео с их участием

Биозавивка и кератиновое выпрямление

С кератиновым выпрямлением у биозавивки сложились интересные отношения:
    •    На гладких и насыщенных кератином волосах завитушки либо совсем не образовываются, либо делают это некачественно, так что такое сочетание не принесет клиенту радости.
    •    С другой стороны, убрать неудачную или надоевшую завивку сможет именно кератиновое выпрямление. Более того, оно продемонстрирует свои лечебные качества, добавив шевелюре шелковистость и блеск.

Уход после биозавивки

Вкратце можно разложить советы по уходу за завитками на два раздела.
Не рекомендуется:
    •    Мочить и мыть волосы в течение двух суток после биозавивки
    •    Пользоваться расческой типа щетки
    •    Ложиться спать с мокрой шевелюрой
    •    Первое время использовать резинки и заколки
    •    Перегревать волосы на солнце, в бане, сауне
    •    Использовать в уходе обычные маски для волос
Следует:
    •    Мыть голову в вертикальном положении, слегка отклонив ее назад
    •    Распутывать волосы во влажном состоянии пальцами рук или гребешком с редкими зубчиками
    •    Сушить шевелюру без применения горячего режима фена, после мытья аккуратно промокнув их полотенцем
    •    Использовать стайлинговые средства для кудрявых и завитых волос
    •    Посещать салонные процедуры для укрепления и восстановления прически

СПА-программа абсолютное счастье для волос наше видео

Укладка волос после биозавивки  

Укладка завитых волос – сплошное наслаждение. Она займет не более трех минут: разделить влажные завитки пальцами, нанести стайлинговое средство… все! Более сложные сценарии укладки так же просты и непродолжительны:
    •    Эффект мокрых волос. На влажные распутанные завитки наносится мусс или гель.
    •    Естественная красота. Шевелюра укладывается при помощи диффузора, пенки и лака.
    •    Четкие локоны. Здесь применяются различные по форме и материалу бигуди, позволяющие «играть» с биозавивкой на разный манер.

Полезные советы

    •    Доверьте свою красоту действительно опытному и надежному специалисту.
    •    Перед принятием окончательного решения удостоверьтесь, что не попадаете ни под одно из противопоказаний к биозавивке.
    •    Не поленитесь сделать аллергический тест перед процедурой.
    •    Следуйте советам мастера по уходу и укладке завитков.
    •    Используйте профессиональные средства для кудрявых волос и избегайте сомнительных брендов.
    •    Посещайте салон красоты и поддерживайте новую прическу подрезанием секущихся кончиков и ухаживающими процедурами для волос. Кудряшки отлично смотрятся только на ухоженных и здоровых волосах.
    •    Уважайте свою красоту и никогда не подвергайте ее излишнему риску.

Пусть биозавивка воплотит в жизнь ваши мечты и превзойдет самые смелые ожидания!

О противопоказаниях к биозавивке можете прочесть здесь 

Ответы на вопросы по биозавивке волос здесь

Работы наших мастеров по окрашиванию волос

Список производителей:

Италия:

США:

Франция

Россия

Япония

БИОЗАВИВКА ВОЛОС КИЕВ, БИОЗАВИВКА МОССА, БИОЗАВИВКА ЦЕНА КИЕВ, БИОЗАВИВКА ВОЛОС MOSSA, БИОЗАВИВКА ФОТО, БИОЗАВИВКА ВОЛОС, БИОЗАВИВКА ЛОКОНЫ, БИОЗАВИВКА ВОЛОС ОТЗЫВЫ, Работаю с биозавивкой с момента появления ее на Украине! Консультация и запись по телефону: 067 907 12 11

Внимание! Все работы биозавивки Mossa на фото- мои и защищены авторским правом!

Биозавивка волос MOSSA Киев

Биозавивка волос фото Mossa

Биозавивка волос Mossa 2013 февраль

MOSSA био-завивка волос 2009

Обновленный препарат биозавивки Mossa 2011

Биозавивка волос MOSSA

MOSSA биозавивка волос 2009

MOSSA биозавивка фото 2009 май

Биозавивка волос MOSSA 2009

Биозавивка волос MOSSA Киев

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос фото MOSSA

Биозавивка MOSSA Киев фото

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Линия реконструкции волос

Биозавивка MOSSA

Биозавивка MOSSA фото Киев

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка Mossa

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос MOSSA

Биозавивка MOSSA

Биозавивка волос Mossa Киев

Биозавивка волос Киев Mossa

Биозавивка Mossa

Биозавивка Киев MOSSA

Биозавивка волос MOSSA фото

Биозавивка Киев MOSSA фото

Биозавивка волос MOSSA Киев

MOSSA биозавивка волос 2009

MOSSA биозавивка 2009 май

MOSSA биозавивка волос 2009

Биозавивка волос MOSSA

Био- завивка MOSSA 2009 май

MOSSA биозавивка волос 2009

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка волос Mossa фото

Биозавивка волос MOSSA 2009

Биозавивка фото Mossa

Биозавивка волос фото Mossa

Наращивание волос

Наращивание волос

Наращивание волос

Биозавивка волос Киев Mossa

Биозавивка MOSSA 2009 июнь

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка Mossa Киев фото

Биозавивка волос MOSSA 2009 июнь

Биозавивка Mossa

Биозавивка волос Mossa

MOSSA биозавивка волос 2009 июнь

Биозавивка Mossa фото Киев

Биозавивка MOSSA 2009 июнь

Биозавивка волос Mossa

MOSSA биозавивка фото 2009 июнь

Биозавивка Mossa фото Киев

Биозавивка Mossa фото

Биозавивка волос фото Mossa

Биозавивка MOSSA фото 2010

Биозавивка MOSSA 2010

MOSSA биозавивка волос фото 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос MOSSA 2010

Биозавивка волос MOSSA 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос Киев MOSSA 2010

Биозавивка волос MOSSA фото 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

MOSSA биозавивка волос 2010

Биозавивка волос MOSSA 2010

Биозавивка Киев Mossa 2011 май

Mossa биозавивка 2011 июнь

Биозавивка фото Киев Mossa 2011 май

Биозавивка волос Mossa 2011 май

Биозавивка Mossa 2011 июнь

Mossa фото 2011 май

Mossa биозавивка волос фото 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 май

Mossa биозавивка волос 2011 май

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Mossa биозавивка фото 2011 июнь

Mossa фото биозавивка волос 2011 июнь

Биозавивка волос Mossa 2011 июнь

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос Mossa 2013 февраль

Биозавивка волос Mossa

Биозавивка волос Киев 2013

Биозавивка волос Мосса

Биозавивка волос Мосса Киев 2013

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос цена Мосса Киев 2013

Био-завивка волос Мосса

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос цена Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка фото Киев

Биозавивка 2013 Мосса

Биозавивка волос Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка волос фото Киев

Биозавивка волос 2013 Мосса

Биозавивка фото Киев

Биозавивка апрель 2013 Киев

Неакадемические исследовательские, природоохранные и реабилитационные организации

Хотя мы надеемся, что этот список поможет в вашем поиске, мы признаем, что он представляет лишь часть потенциальных ресурсов.

Примечание. Щелкнув следующие ссылки, вы покинете веб-сайт Комиссии по морским млекопитающим. Мы не можем подтвердить точность информации, предоставленной каким-либо из этих сторонних сайтов, и не одобряем информацию, продукты или услуги, содержащиеся на них.

Ниже перечислены в алфавитном порядке.

Западная часть США

  • Центр морской жизни на Аляске — Сьюард, AK
  • Alaska Whale Foundation — Петербург, АК
  • Биоволны — Энсинитас, Калифорния
  • Исследовательский коллектив Cascadia — Олимпия, Вашингтон
  • Центр исследования китов — Фрайдей Харбор, Вашингтон
  • Исследовательская организация Cetos — Сан-Франциско, Калифорния
  • Проект фотоидентификации белуги в заливе Кука — Анкоридж, AK
  • Исследовательская группа морских слонов — Санта-Крус, Калифорния
  • Исследовательский институт Морского мира им. Хаббса — Сан-Диего, Калифорния
  • Исследования морской жизни — высадка на мох, Калифорния
  • Морская экология и телеметрические исследования — Сибек, Вашингтон
  • Исследовательский институт аквариума Монтерей-Бей — Монтерей, Калифорния
  • Национальный фонд морских млекопитающих — Сан-Диего, Калифорния
  • Общество океанов Северного залива — Гомер, AK
  • North Pacific Research Board — Анкоридж, AK
  • Общество охраны океана — Марина дель Рей, Калифорния
  • Океанский научный институт — Макавао, Гавайи
  • Фонд тихоокеанских китов — Kihei, HI
  • Point Blue Conservation Science — Болинас, Калифорния
  • San Diego Institute for Conservation Research — Сан-Диего, Калифорния
  • Институт дельфинов — Хило, HI
  • Центр морских млекопитающих — Саусалито, Калифорния, и Кона, Гавайи
  • Музей китов — Фрайдей Харбор, WA
  • Океанариум Вайкики — Гонолулу, Гавайи
  • Whale Trust — Макавао, Гавайи
  • Исследование крылатых китов — Гомер, AK

Южный У.

С.

Северо-восток США

Средний Запад и Средняя Атлантика США

Международный

Нет ничего более зеленого, чем кажется

Международная выставка современной мебели, сокращенно ICFF, обычно считается самой важной мебельной ярмаркой в ​​Соединенных Штатах. Достойная цель — познакомить посетителей с текущими и будущими тенденциями отрасли. Это стремление не всегда выполняется. Таким образом, посетители вскоре начнут задавать первые вопросы: если дизайнеры интерьеров Джинджер Криг Дозиер так долго изучали биотехнологию, пока не смогли «развести» кирпичи из песка и бактерий, то это биотехнология или дизайн? И действительно ли этого эксперимента достаточно, чтобы занять первое место в призах ICFF «Новое поколение дизайна»?

Это не проблема в США.Термин «дизайн» здесь определяется гораздо шире, чем в неанглоязычной Европе, где «дизайн» обычно относится к созданию и формированию мебели и продуктов. Разница между Европой и Соединенными Штатами становится еще яснее, когда речь идет о «хорошем дизайне». В Америке хорошее сейчас означает добро для вашей совести. Красота не важна, а критериев качества нет. 1 — это устойчивость, независимо от того, идет ли речь о серьезной экологической осведомленности или это просто дымовая завеса.

Различия, когда дело доходит до определения и оценки устойчивости, становятся очень очевидными, если мы возьмем для примера уже четвертое издание «Национальной триеннале дизайна».Он был запущен как раз к выставке ICFF в Национальном музее дизайна Купер-Хьюитт и посвящен вопросам устойчивости, что неудивительно. Что касается устойчивости, то 135 экспонатов должны были ответить на вопрос: «Почему именно сейчас?». В их число входят интересные проекты, которые также считаются хорошим дизайном в Европе, такие как «CityCar», созданный Массачусетским технологическим институтом Массачусетского технологического института. Компактный электромобиль предназначен для систем каршеринга и, по сути, может быть сложен для парковки, так что от трех до четырех из них можно припарковать в пространстве, необходимом для одного автомобиля сегодня. Тем не менее, есть бесчисленное множество экспонатов, которые нужно проявить любезностью, чтобы считать их экологичными, например, iPhone, Kindle, Twitter или «Обои знаменитостей», созданные Мике Герритцен. Это кусок обоев, на которых миниатюрные лица знаменитостей создают узор — раскрашенный вручную в Китае. А в «Коллекции охоты за цветом» Иссея Мияке спрашивают, действительно ли 3000 образцов цветов, собранных в Амазонии, и получившаяся в результате модная коллекция, «передают ясный и фундаментальный посыл о том, что мы должны защищать тропический лес.

Точно так же выставка под названием «Personalissimo: этический дизайн> итальянский стиль» была неубедительной — на ней были представлены 40 ломбардских компаний и произвольный ассортимент продукции. В сопроводительных текстах перечисляются этические свойства продуктов, но при этом не выходят за рамки модных словечек или определений. такие термины, как «этика языкового общения». В любом случае основные производители из Ломбардии не участвовали в этом.

Таким образом, Cappellini, Molteni & C, Minotti, Agape & Co остановили свой выбор на собственных, частично в новых выставочных залах. и отказались от стендов на выставке, как и большинство других европейских производителей.Итальянский производитель светильников Flos, например, открыл свой выставочный зал рядом с дизайнерской галереей Moss, дверь соединяет два магазина, а другая ведет в выставочный зал Moroso, расположенным на одно здание дальше. Почти все эти выставочные залы расположены в Сохо, дизайнерском районе Нью-Йорка, так что весь район стал местом, где можно было бы быть.

Немного в стороне от проторенных дорог, в Концептуальном магазине № 8 в Нижнем Ист-Сайде, немецкий производитель e15 представил новую линию сидений Стефана Диеса — хотя и в замороженном сахаре, поскольку настоящая мебель все еще застряла в Амстердаме в контейнер из-за облака пепла.Тем не менее, как и все другие материалы, которые использует e-15, сахар можно переработать. И никаких дополнительных указателей на это не было. Наконец-то доказательство того, что добро и прекрасное не должны быть противоречиями.

В центре самого модного квартала Нью-Йорка, Meatpacking District, находится трехэтажный выставочный зал, который Vitra делит со швейцарским производителем текстиля Création Baumann. Последний представил захватывающие установки для лазерной резки ткани и имеет практически все соответствующие экологические сертификаты на свою продукцию.Vitra в основном специализируется на «Кресле Panton», которому в этом году исполняется 50 лет. Как и «Vegetal» Ронана и Эрвана Буруллеков, который также был на выставке, он сделан из пластика и, таким образом, идет вразрез с экологическим уклоном Нью-Йорка. Однако вы не просто выбрасываете Panton или Vegetal, а передаете их семье. Что в значительной степени является практикой устойчивости.

www.icff.com

Биофермы растений: новое понимание экспрессии пептидов в гетерологичных системах

Наземные мхи используются в качестве биоиндикаторов с 1960-х годов (Rühling, Tyler, 1973). Первые крупномасштабные исследования, в которых сообщалось о концентрациях отдельных микроэлементов (As, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, V, Zn), были проведены в Скандинавии в 1985 г. (Poikolainen et al., 2004 ). С тех пор многие европейские ученые использовали технику мха для решения различных задач: (i) для документирования химического состава атмосферы, (ii) для составления карты экогеохимических изменений в окружающей среде, (iii) для определения основных источников загрязнения атмосферы и (iv) чтобы найти контраст между фоновой концентрацией элементов и концентрацией элементов в «горячих точках» на загрязненных территориях (Caritat et al., 2001). Наземные мхи нашли практическое применение в исследованиях биомониторинга благодаря своим морфологическим и физиологическим свойствам. Отсутствие кутикулы и корневой системы приводит к тому, что их клеточные стенки легко проникают ионы металлов. Это позволяет поглощать элементы и твердые частицы от дождя, таяния снега и сухих отложений. Они также обладают высокой катионообменной способностью удерживать и транспортировать многие элементы. Мхи широко распространены, они произрастают в различных местообитаниях, и их годовые приросты легко определить.Концентрации микроэлементов в тканях мха зависят от отдельных видов мхов и их морфологии, а также от литологии коренных пород и многих других факторов окружающей среды, то есть топографии, климата, гидрологии и эдафических (связанных с почвой) условий. Местные топографические, климатические и почвенные переменные обычно коррелируют с геологическими условиями района исследования. Различные виды мхов демонстрируют различные различия в концентрациях элементов и некоторых органических веществ. Это вызвано, прежде всего, разнообразными ассимиляционными способностями.Эти факты накладывают некоторые ограничения на выбор конкретного вида мха для целей биомониторинга. Несколько видов (Hylocomium splendens, Pleurozium schreberi, Scleropodium purum, Hypnum cupressiforme) успешно использовались в программах биомониторинга (Berg, Steinnes, 1997), но все эти виды должны иметь приемлемую плотность выборки, что имеет решающее значение для идентификации видозависимых изменчивость. Следует подчеркнуть, что техника мох имеет множество преимуществ. Это проще и дешевле, чем традиционный анализ осадков, основанный на большом количестве пробоотборников.Этот метод также позволяет нам отслеживать несколько сайтов по невысокой цене. Более того, концентрации элементов в тканях мха достаточно высоки, чтобы упростить анализ (Harmens et al., 2004).

% PDF-1.4
%
683 0 объект
>
эндобдж

xref
620 64
0000001752 00000 н.
0000002691 00000 н.
0000003063 00000 н.
0000003330 00000 н.
0000004010 00000 п.
0000004462 00000 н.
0000009956 00000 н.
0000010345 00000 п.
0000010681 00000 п.
0000013462 00000 п.
0000013883 00000 п.
0000014244 00000 п.
0000017996 00000 п.
0000018227 00000 п.
0000018378 00000 п.
0000018694 00000 п.
0000019562 00000 п.
0000019929 00000 п.
0000020261 00000 п.
0000022761 00000 п.
0000023536 00000 п.
0000024159 00000 п.
0000031833 00000 п.
0000032563 00000 п.
0000033107 00000 п.
0000038548 00000 п.
0000039177 00000 п.
0000039578 00000 п.
0000042565 00000 п.
0000042858 00000 п.
0000043012 00000 п.
0000043996 00000 п.
0000044052 00000 п.
0000044911 00000 п.
0000045037 00000 п.
0000045220 00000 п.
0000045317 00000 п.
0000045441 00000 п.
0000045507 00000 п.
0000046587 00000 п.
0000051713 00000 п.
0000051927 00000 п.
0000052056 00000 п.
0000052185 00000 п.
0000052314 00000 п.
0000052444 00000 п.
0000052570 00000 п.
0000052699 00000 п.
0000052828 00000 п.
0000052959 00000 п.
0000053088 00000 п.
0000053217 00000 п.
0000053347 00000 п.
0000053475 00000 п.
0000053603 00000 п.
0000053800 00000 п.
0000053868 00000 п.
0000054119 00000 п.
0000054237 00000 п.
0000054377 00000 п.
0000054504 00000 п.
0000054636 00000 п.
0000001940 00000 н.
0000000017 00000 н.
трейлер
]
>>
startxref
0
%% EOF

620 0 объект
>
эндобдж
682 0 объект
>
ручей
xc«e«? А
31130pdlf˔T] / t ܉ u {ֆ Mb 0 [ܲ ^ p ^ v & [UgZxefw! IxfUaHM% U1G. 0% * (M`G) \, LY) = |! _2 V &, PfTTfrҠdp (C% _Y «8 ש $ 6 x; rwd; r6 / ~ $ ۘ A @ + C> ik8yv1yKv

Основные силы полярности ооцитов являются эволюционными Сохраняется, но не может влиять на вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцисты у млекопитающих

Abstract

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо известные особенности развития у низших видов. Существует ли подобная форма предварительного формирования паттерна у млекопитающих, в настоящее время ведутся горячие споры у мышей.В этом исследовании этот вопрос был впервые исследован на овце как на модели крупного млекопитающего. Микрохирургическая трисекция неоплодотворенных MII-ооцитов показала, что кортикальная цитоплазма вокруг веретена (S) содержала значительные количества общих материнских мРНК и белков по сравнению с соответствующими полушариями цитопластов, которые были расположены либо рядом (NS), либо далеко (FS) от веретена. RT-qPCR предоставила яркие примеры материнской мРНК, локализованной в субструктурах S ( NPM2 , GMNN , h29 , PCAF , DNMT3 A, DNMT1 и STELLA , NANOG , POU5F1 и TET1 ) и FS ( GCN ) ооцита MII. Иммуноблоттинг показал, что специфические материнские белки DNMT3A и NANOG были асимметрично обогащены в MII-веретено-половине ооцитов. Топологический анализ точки входа сперматозоидов (SEP) показал, что сперматозоиды преимущественно поступают через половину веретена MII ооцитов. При этом топологическое положение первой плоскости спайности относительно SEP было вполне стохастическим. Пространственное сравнение содержания липидов выявило симметричное распределение липидов между двухклеточными бластомерами. Отслеживание клонов с использованием флуоресцентного красителя Dil показало, что, хотя потомство ведущего бластомера двухклеточного эмбриона вносило вклад в большее количество клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающим аналогом, вклад ведущих и отстающих бластомеров в эмбрионально-абебриональные части эмбриона. развитые бластоцисты были почти беспристрастными.И, наконец, разделенные сестринские бластомеры 2-клеточных эмбрионов имели в целом одинаковую вероятность остановки на любой стадии до бластоцисты (2-клеточная, 4-клеточная, 8-клеточная и морула) или достижения стадии бластоцисты. Был сделан вывод, что локализация материнских мРНК и белков в веретене эволюционно консервативна для млекопитающих, неоплодотворенный овец ооцит может считаться полярным в отношении пространственной регионализации материнских транскриптов и белков. Даже несмотря на то, что основные силы этой окончательной полярности ооцитов могут не сохраняться во время эмбрионального дробления.

Образец цитирования: Hosseini S-M, Moulavi F, Tanhaie-Vash N, Asgari V, Ghanaei H-R, Abedi-Dorche M, et al. (2016) Основные силы полярности ооцитов эволюционно сохраняются, но не могут влиять на вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцист у млекопитающих. PLoS ONE 11 (3):
e0148382.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382

Редактор: Цин-Юань Сунь, Институт зоологии Китайской академии наук, КИТАЙ

Поступила: 9 сентября 2015 г .; Одобрена: 18 января 2016 г .; Опубликовано: 31 марта 2016 г.

Авторские права: © 2016 Hosseini et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Нет данных для размещения на веб-сайте. Все данные были включены в рукопись.

Финансирование: Эта работа была поддержана IRAN253658, Институтом Рояна. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо установленные особенности развития у низших видов [1]. Однако давний вопрос в развитии млекопитающих заключается в том, как впервые устанавливается эмбрионально-абэмбриональная ось бластоцисты. Ответ на этот вопрос критически важен для того, чтобы знать, являются ли деления дробления, которые регулируют формирование эмбриональных осей, предварительно сформированными [2, 3] или влияют на установление тотипотентности [4] в развитии млекопитающих.В настоящее время существуют три классические модели для объяснения механизма спецификации ранних клеточных клонов у млекопитающих: «предварительное формирование паттерна», «внутреннее-внешнее» и «клеточная полярность» [3]. В модели до формирования паттерна аналогичен механизму, который существует у Drosophila , C . elegans и Xenopus , детерминанты формирования эмбриональной оси ожидаются либо во время созревания ооцитов, либо после оплодотворения [5]. Модель внутри-снаружи указывает на важность топологического положения клеток на стадии морулы в формировании паттерна бластоцисты [6].И модель клеточной полярности указывает на важность апикальных и дистальных мембранных доменов, которые появляются на стадии эмбриона от 8 до 16 клеток в спецификации судьбы потомков эмбриональных клеток [7].

Основные механизмы формирования эмбриональных осей у млекопитающих изучены не полностью. У мышей, как наиболее изученной системы, механизм фиксации первой линии в настоящее время является предметом горячих споров. Ряд исследований полагают, что судьба мышиных клеток предустановлена, а потомки эмбриональных клеток, возникающие в результате первого деления дробления, имеют различимые судьбы [5, 8, 9, 10, 11].Напротив, другие исследования полагают, что порядок дробления не определяет распределение клеток в эмбрионально-абэмбриональных регионах [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]. Асимметричная локализация материнских транскриптов является важным детерминантом полярности, управляющим цис-регуляцией зиготических генов у многоклеточных животных [20, 21, 22]. Хотя предполагается сохранение этого механизма развития у млекопитающих, недавние сообщения противоречат аргументам как в пользу [1, 4, 21, 23, 24, 25], так и против [16, 26] идеи полярности ооцитов у мышей.Примечательно, что ряд исследований продемонстрировал, что оплодотворяющая сперма имеет предпочтительную точку входа (SEP) в ооцит у мышей [10, 16]. Даже несмотря на то, что последующее исследование последней группы предоставило доказательства того, что пространственная асимметрия, проявляемая первым полярным телом и пеллюцидной оболочкой, направляет SEP [18]. Если транскрипционная асимметрия действительно существует в неоплодотворенных ооцитах млекопитающих, возможно, что механизм формирования эмбриональной оси у высших млекопитающих устанавливается до оплодотворения, когда ооцит становится поляризованным.

Почему важно изучение паттерна эмбриона? В течение многих лет рекомендуется вводить сперму вдали от первого полярного тельца во время интрацитопальмической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) [27]. Перенос ядра соматической клетки (SCNT) осуществляется путем удаления части ооплазмы, охватывающей MII-хромосомы [28]. Монозиготное сплетение имеет большие потенциальные последствия для размножения элитных животных и животных, находящихся под угрозой исчезновения [29]. Недавно монозиготное сплетение с использованием малых молекул предоставило многообещающую возможность разделить эмбрион на две части: часть, которая разовьется до срока, и другая часть, которую можно культивировать in vitro для создания аутологичных эмбриональных стволовых клеток (ESC) для своего хозяина [30, 31]. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) все чаще используется для выявления возможных генетических заболеваний или хромосомных аномалий эмбрионов. При рутинной процедуре ПГД биопсия одного (или нескольких) бластомеров проводится у эмбриона на третий день [32]. Все эти методы были разработаны на основе давней концепции, согласно которой у млекопитающих ооцит является симметричным, а бальстомеры ранних эмбрионов равны по своей компетенции. Даже если дальнейшие исследования могут подтвердить существование цитоплазматической «полярности» ооцитов и «неравенства» ранних бластомеров, могут потребоваться серьезные уточнения / модификации этих манипулятивных / диагностических методов [33].

Отслеживание клонов эмбрионов на стадии дробления плохо изучено у видов млекопитающих, а не у мышей, и только два исследования оценили формирование паттерна эмбриона у свиней [34, 35]. Однако выбор адекватной животной модели для проверки биологических гипотез по-прежнему остается открытой проблемой, и все больше данных свидетельствует о том, что мышь не может быть подходящей моделью для биологических исследований на людях. Учитывая современные знания об образовании эмбриональной оси у мышей и из-за того, что существует близкое сходство между человеческими и овечьими эмбрионами с точки зрения метаболизма и ключевых стадий до и после имплантационного развития [36, 37, 38], мы использовали овец в качестве животного. модель для оценки вероятности полярности ооцитов и формирования паттерна эмбриона у видов млекопитающих.

Материалы и методы

Если не указано иное, все химические вещества и среды были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США) и Gibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) соответственно. Все процедуры, предпринятые в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Института Рояна.

Подготовка яйцеклеток и производство эмбрионов

Процедуры, используемые для подготовки ооцитов и получения эмбрионов in vitro, были такими, как описано ранее [28].Короче говоря, всего 2308 яичников взрослых овец местных пород (в основном афшари и найени в возрасте от 9 месяцев до 7 лет) были получены на двух местных бойнях (города Хомейнишахр и Кашан) в провинции Исфахан, антральные фолликулы (2). -6 мм в диаметре) яичников аспирировали для получения кумулюсно-ооцитных комплексов (КОК). Выбранные КОК с гомогенной цитоплазмой и более чем тремя слоями окружающих кумулюсных клеток промывали трижды в среде 199 для культивирования тканей, забуференной гепесом (HTCM199) + 10% овечьей сыворотки (SS), с последующими тремя дополнительными промываниями в среде для созревания (TCM199, содержащей 2.5 мМ Na-пируват, 1 мМ L-глутамин, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10% SS, 10 мкг / мл овечьего ФСГ, 10 мкг / мл овечьего ЛГ, 1 мкг / мл эстрадиола-17β, и 0,1 мМ цистеамина). Затем ооциты культивировали в течение 20–22 ч группами по 20–25 человек в каплях по 100 мкл среды для созревания, покрытых минеральным маслом при 38,5 ° C, 5% CO 2 и увлажненном воздухе. Созревшие КОК затем использовали для развития эмбриона, а предполагаемые зиготы культивировали группами по 6-8 человек в каплях 20 мкл модифицированного состава описанной синтетической жидкости яйцевода (mSOF) при 39 ° C, 6% CO 2 , 5% O 2 и увлажненный воздух на 168 ч [39].

Пространственное распределение материнской мРНК в MII-ооцитах

Чтобы понять пространственное распределение транскриптов в неоплодотворенных MII-ооцитах, метод трисекции ооцитов был использован для создания кортикальных материалов, содержащих материал веретена MII (S) и половины ооцитов, которые были либо близкими (NS), либо далекими от ( FS) шпиндель MII (рис. 1 и 2A, видео S1). Для этого MII-ооциты сначала обрабатывали проназой (0,05% в HTCM199) для удаления зоны. Ранее было показано, что после удаления зоны MII-ооциты овцы частично вытесняют веретено MII и связанные с ним хромосомы в виде четко видимого цитоплазматического выпячивания.Этот цитоплазматический выпячивание легко различить как референтное положение для правильного деления пополам MII-ооцита к половинкам NS и FS, как описано в другом месте [40]. Полученные половинки NS затем использовали для приготовления кортикального материала, содержащего MII-хромосомы (S) и энуклеированные половинки NS, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, IX71, Япония), оснащенного системой микроманипуляторов (Narishige, Япония). Плазматическая мембрана обычно инкапсулирует изолированную MII-хромосому в виде интактного цитоплазматического фрагмента.Чтобы подтвердить успешное рассечение и удаление веретена, ооциты окрашивали Hoechst 33342 (5 мкг / мл, 5 мин) перед микрохирургией. Затем разрезанные ооциты визуализировали кратковременным УФ-облучением. Для каждой повторности пулы цитоплазматических фрагментов S, NS и FS были приготовлены из 100–150 ооцитов.

Рис. 1. Схематическое изображение процедуры микрохирургической трисекции неоплодотворенных MII-ооцитов овцы с использованием ручного метода трисекции ооцитов.

A, B) Созревшие in vitro ооциты были очищены от кумулюсных клеток, и ооциты с очевидным первым полярным тельцем (1Pb) были отобраны для удаления зоны.C) Ооциты овцы частично выдавливают веретено MII и связанные с ним хромосомы (S) в виде цитоплазматического выступа, который особенно очевиден после удаления зоны. D) Используя этот цитоплазматический выступ в качестве контрольной точки, ооциты сначала делят пополам на полушария ооцита, которые находятся либо близко (NS), либо далеко от (FS) веретена MII (S). E) Полученные полушария NS-ооцитов затем использовали для приготовления кортикальных материалов, содержащих MII-хромосомы (S) и энуклеированные полушария NS-ооцитов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g001

Рис. 2. Исследование ассиметрии транскриптов в ооците и раннем эмбрионе.

A) Неоплодотворенные MII-ооциты овцы подвергали микрохирургической трисекции для получения кортикальных материалов, содержащих материал веретена MII (S) и полушария ооцита, которые находились либо близко (NS), либо далеко от (FS) веретена MII. Были приготовлены пулы цитоплазматических фрагментов S, NS и FS, которые использовали для сравнительной RT-qPCR с использованием 21 гена, важного для развития.Полученные профили выявили четыре образца содержания транскриптов в трех фрагментах ооцита. B) Чтобы понять, наследуют ли ранние эмбрионы овцы дифференциальную локализацию транскриптов, наблюдаемую в MII-ооците, транскрипционное распределение транскриптов между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами было исследовано с помощью RT-qPCR. Для этой цели один бластомер раннего эмбриона овцы был помечен Dil, и за эмбрионами наблюдали во время первого и второго эмбриональных делений для создания пулов ведущих и отстающих бластомеров.Ведущий и запаздывающий пулы бластомеров использовали для количественного анализа тех транскриптов, которые, как было обнаружено, дифференциально локализованы с неоплодотворенными ооцитами MII.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g002

Пространственное распределение материнской мРНК между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов

Чтобы понять распределение транскриптов между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами (рис. 2В), 2-клеточные эмбрионы овцы были собраны примерно через 18 часов после ЭКО и использованы для случайной маркировки одного сестринского бластомера с использованием флуоресцентного красителя Dil (1,10-диоктадецил-3, 3,30,30-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат), как описано Park et al.[35]. Вкратце, Dil растворяли в кукурузном масле в концентрации 2,5 мг / мл при 60 ° C, давали остыть и затем сразу использовали. Микропипетка с очень острым скосом была заполнена красителем и присоединена к инвертированному микроскопу (Olympus, IX71, Япония), оборудованному системой микроманипуляторов Narishige. Мечение было выполнено путем внутрицитоплазматической инъекции капель Dil случайным образом в один двухклеточный бластомер. Затем меченые эмбрионы культивировали в среде mSOF для мониторинга расщепления и улавливания 3-х клеточных эмбрионов перед делением 3 клетки → 4 клетки.Три клеточных эмбриона обрабатывали проназой для удаления зоны и осторожно пипетировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) для отделения бластомеров. Используя инвертированный флуоресцентный микроскоп, отдельные бластомеры наблюдали при кратковременном УФ-облучении, чтобы собрать сестринские бластомеры второго расщепления (происходящие из ведущего бластомера) и отстающие бластомеры (происходящие из первого расщепления) в двух отдельных пулах (рис. 2). Образцы в минимальной посторонней среде были отдельно взяты в пипетку и барботированы в буфер RLT, который должен храниться в замороженном состоянии (-70 ° C) до экстракции РНК и количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR).

Пространственное распределение сырых белков в неоплодотворенных овоцитах MII

Чтобы понять пространственное распределение белков в неоплодотворенных MII-ооцитах, с помощью ручного метода трисекции ооцитов были приготовлены пулы фрагментов S, NS и FS ооцитов (по 300 каждый) (рис. 1 и 2A, видео S1). Фрагменты ооцитов дважды промывали центрифугированием в PBS. Затем фрагменты удаляли из PBS и лизировали осторожным пипетированием в 150 мкл реагента TRI (Sigma) в соответствии с протоколом производителя.Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорда (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, фракцию солюбилизированного белка каждого образца (10 мкг) подвергали электрофорезу в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS). Стадию фиксации геля (30% этанол, 10% уксусная кислота) выполняли в течение 4 ч, а затем гель окрашивали коммерческим серебром. SDS-PAGE непрерывно проявляли в течение 10 минут для выявления белковых пятен. В качестве стандартов молекулярной массы одновременно использовали маркеры молекулярной массы белков (14–200 кДа, Amersham).

Пространственное распределение специфических белков в неоплодотворенных ооцитах MII овцы

Чтобы понять поляризованное распределение особых материнских белков в неоплодотворенных MII-ооцитах, всего 3752 овечьих MII-ооцитов из 15 повторов были использованы для ручного деления пополам, чтобы подготовить достаточное количество фрагментов NS и FS ооцитов для иммуноблоттинга (рис. 1 и 2A, видео S1). Чтобы убедиться в специфичности антител, иммуноблоттинг был проведен на тканях (яичках и печени) и фибробластах овцы.Процедура иммуноблоттинга была описана ранее [31]. Вкратце, экстракцию белка проводили с помощью реагента TRI (Sigma-Aldrich). SDS-PAGE выполняли при 120 В в течение 2 ч с использованием клеток Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad). Разделенные белки переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF; Bio-Rad) влажным блоттингом (Bio-Rad). Мембраны блокировали в течение 1 ч 10% обезжиренным молоком и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с соответствующими первичными антителами: анти-NANOG (Sigma # N3038, 1: 200), анти-DNM3A (IMG # 268A, 1: 1000) и антиглицеральдегидфосфатдегидрогеназа (анти-GAPDH) (Sigma-Aldrich # A2228, 1: 5000). В конце инкубационного периода мембраны промывали смесью трис-буферного солевого раствора с твином 20 (TBST, 0,1% об. / Об.) Трижды по 15 мин каждый, с последующей инкубацией с конъюгированным с HRP вторичным антителом (козьими антигенами). -мышь (Dako # P0447, 1: 5000)). Связывание конъюгированного с HRP IgG с полосами белка визуализировали с помощью набора для обнаружения вестерн-блоттинга Amersham ECL Advance (GE Healthcare).

Топологическая оценка SEP в яйцах овец

Чтобы выяснить, является ли SEP случайным или специфическим в яйцах овец, мы исследовали топологическое расположение SEP в оплодотворенных ооцитах.В пилотных экспериментах по определению оптимального временного окна для достижения максимального раннего оплодотворения яйца овец через разные интервалы (ч) после оплодотворения (hpf: 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 12) были очищены от окружающих кумулюсных клеток. а затем обработали 0,25% проназой для удаления зоны. Затем зиготы фиксировали, окрашивали Hoechst-33342 и оценивали наличие конденсированной головки сперматозоида на периферии ооцита, как описано Schurmann et al. [41]. В другом наборе пилотных экспериментов для определения взаимосвязи между веретеном MII и первым полярным тельцем (pb) неоплодотворенные ооциты фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в PBS и окрашивали Hoechst-33342.Затем была оценена топологическая взаимосвязь между веретеном MII и pb с использованием флуоресцентного микроскопа для микроманипуляций, как описано Rienzi et al. [42]. Первая серия пилотных экспериментов установила, что интервал 4-6 часов оплодотворения является оптимальным для достижения максимального раннего оплодотворения конденсированной периферической спермой (таблица S1). Полученные результаты второй серии пилотных экспериментов (таблица S2) показали, что в соответствии с исследованиями Hardarson et al. [43] и Rienzi et al.[42] у человека pb является слабым индикатором MII-веретена, потому что он сильно смещается и отклоняется в пространственном положении относительно MII-веретена, особенно после механической денудации с помощью вихря.

Процедура оценки SEP была в соответствии с Motosugi et al. [18] с некоторыми изменениями. Вкратце, кучевую корону диспергировали через 4–6 часов после оплодотворения (что составляет 26–28 часов после внутривенного вливания) осторожным пипетированием в 300 МЕ / мл гиалорунидазы в HTCM199, окрашивали Hoechst-33342 и переносили на предметный столик микроскопа микроманипулятора.Небольшую каплю Dil вводили в zona pelucida, непосредственно покрывающую мейотическое веретено, с помощью микроманипулятора с флуоресцентным оборудованием (Olympus, BX51, Япония). Только зиготы, имеющие конденсированный сперматозоид, использовали для Dil-мечения положения мейотического веретена, и неоплодотворенные ооциты или полиспермические зиготы были исключены. Меченые зиготы инкубировали в 0,5% дигидрате цитрата натрия в течение нескольких минут до тех пор, пока часть цитоплазмы не выступила через крошечное отверстие в ZP, которое было введено проникающей спермой.Предполагаемые зиготы с четким выступом фиксировали в 4% PFA в PBS, окрашивали Hoechst-33342 и оценивали на предмет SEP с использованием микроманипулятора с флуоресцентным оборудованием (Olympus, BX51, Япония). Чтобы картировать SEP, зиготу вращали под постоянным УФ-светом и с помощью микроманипулятора выровняли две точки интереса, мейотическое веретено (помеченное инъекцией Dil в вышележащий ZP) и место проникновения сперматозоидов (на основе участка цитоплазматического выступа). от ZP) в фокальной плоскости, пересекающей экваториальную плоскость.Чтобы определить пространственные отношения между SEP и мейотическим веретеном, манипулируемые зиготы были подразделены на четыре воображаемые зоны (зоны I-IV), представляющие диски 3 × 30 ° и диск 1 × 180 °. На этой схеме зона-I была наиболее близкой к мейотическому веретену, тогда как зона-IV была наиболее удаленной от мейотического веретена.

Топологическая взаимосвязь между SEP и первой плоскостью дробления у ранних эмбрионов овец

Чтобы понять возможную топологическую взаимосвязь между SEP и первой плоскостью расщепления, презумптивные зиготы через 4-6 часов после оплодотворения были удалены от кумулюсных клеток, окрашены Hoechst-33342 и перенесены на предметный столик микроскопа микроманипулятора. Чтобы составить карту SEP, яйца вращали с помощью микроманипулятора и под постоянным УФ-светом до тех пор, пока точка интереса, конденсированная проникающая сперма, не была установлена ​​в положение «3 часа». Единственная капля масла была закачана в зону, непосредственно перекрывающую SEP. Меченые зиготы возвращали обратно в их состояние культивирования эмбрионов для мониторинга дробления и первых двух эмбрионов примерно через 8–12 часов после маркировки зоны. Для документации и анализа 2-клеточные эмбрионы были зафиксированы, а затем повернуты под постоянным УФ-светом и с помощью микроманипулятора для совмещения двух точек интереса, SEP (помеченного инъекцией Dil в вышележащий ZP) и плоскости деления в фокальной зоне. самолет, пересекающий экваториальную плоскость.Пространственное соотношение между SEP и плоскостью спайности измеряли, как описано выше.

Пространственное распределение липидных капель между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов овец

Содержание липидов в 2-клеточных эмбрионах было связано со смещенным образованием эмбриональной оси у свиней [34]. Чтобы исследовать эту возможность у овец, 2-клеточные эмбрионы были использованы для анализа общего содержания липидов с использованием нильского красного, флуоресцентного красителя, специфичного для внутриклеточных липидных капель [34, 44].После тщательной промывки в PBS образцы инкубировали с 0,2 мкг / мл нильского красного в течение ночи при 4 ° C. Затем образцы контрастировали с помощью Hoechst-33342, промывали в PBS и помещали на предметные стекла микроскопа в одной капле антифединга. После осторожного сжатия покровным стеклом образцы визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus, BX51, Япония). После экспонирования цифровое изображение каждого образца было снято с помощью высокочувствительной камеры (Olympus DP-72), работающей на программном обеспечении DP2-BSW. Использование изображения J.программного обеспечения (Национальный институт психического здоровья, Бетесда, Мэриленд, США), была проанализирована средняя интенсивность флуоресценции между бластомерами эмбрионов на двухклеточной стадии.

Флуоресцентная маркировка бластомеров

Один бластомер овечьих эмбрионов на двухклеточной стадии был случайным образом помечен флуоресцентным Dil. После приготовления инъекционной иглы, как описано выше, произвольное мечение одного двухклеточного бластомера осуществляли путем интрацитоплазматической инъекции капли Dil, как описано Park et al.[35]. Меченые эмбрионы впоследствии культивировали в соответствующих средах для культивирования эмбрионов и проверяли на предмет второго расщепления каждые 3-4 часа под стереомикроскопом. Эмбрионы на трехклеточной стадии впоследствии исследовали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на последовательность дробления. Эмбрионы были разделены на следующие две группы: 1) ведущие эмбрионы, у которых меченый бластомер расщеплялся первым, 2) отстающие эмбрионы, у которых немеченый бластомер расщеплялся первым. Арестованные эмбрионы (ни один из двухклеточных бластомеров не расщепился во время наблюдения) или эмбрионы с лизированным инъецированным бластомером были исключены из экспериментов, а интактные ведущие и отстающие эмбрионы культивировали еще 120 ч в mSOF. Чтобы понять, может ли отслеживание клонов Dil задерживать развитие эмбриона, регистрировали частоту и порядок расщепления в меченых и немеченых бластомерах двухклеточных эмбрионов.

Наблюдение за эмбрионами

В бластоцистах мышей нет согласия относительно углового градуса между осью Em-Ab и первой плоскостью дробления двухклеточного эмбриона, является спорным [8, 12, 45]. Следовательно, первая плоскость расщепления определяется наиболее подходящей границей между когерентными флуоресцентными и нефлуоресцентными клетками.На основании угла между первой плоскостью дробления и осью Em-Ab (≤30 ° или> 30 °) меченые эмбрионы были классифицированы как ортогональные или девиантные [12]. Мы использовали модифицированный метод оценки бластоцист путем наиболее подходящего подхода к бластоцистам овцы (рис. 3).

Рис. 3. Отслеживание происхождения ведущих и отстающих бластомеров.

Когортная группа бластоцист, полученных из двухклеточных эмбрионов с лидирующей меткой, которые наблюдаются с использованием соответствующих фильтров Hoechst-33342 (A) и родамина (B). В) Критерии сортировки эмбрионов, меченных Dil. Оценка ориентации оси Em-Ab в бластоцистах овцы относительно первой плоскости дробления 2-клеточного эмбриона. После рисования воображаемых линий оси Em-Ab и экваториальной плоскости бластоцисты были разделены на три группы в зависимости от углового отклонения линии границы флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости: i) указано: когда угловое отклонение было почти 90 °, ii) частично заданный: когда угловой вылет был ≥45 °, iii) неуказанный: когда угловой вылет был <45 °.D1-F4) Репрезентативные изображения определенных (D1-D4), полузаданных (E1-E4) и нестандартных (F1-F4), наблюдаемых при ярком свете (D1, E1, & F1), и h43342 (D2, E2) , & F2) и родамина (D3, E3, & F3). На изображениях D4, E4 и F4 показаны объединенные изображения h43342 и родамина. Полоса соответствует 100 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g003

Вкратце, эмбрионы на стадии бластоцисты были зафиксированы, окрашены Hoechst-33342 и использованы для визуализации с помощью инвертированного микроскопа (Olympus, IX71, Япония) оснащен соответствующими фильтрами Rhodamine и Hoechst-33342. При ярком свете каждую бластоцисту первоначально удерживали с помощью пипетки, чтобы установить ICM на 3 или 9 часов. В этой схеме экваториальная плоскость, отделяющая весь ICM и полярный TE от остальной части TE, проходит параллельно плоскости обзора, а ось Em-Ab бластоцисты проходит перпендикулярно экваториальной плоскости [12]. С помощью стеклянной иглы, прикрепленной к системе микроманипулятора Narishige, бластоциста затем осторожно вращалась вдоль эмбрионально-абэмбриональной оси, чтобы определить количество клеток, происходящих из ведущих и отстающих, занимающих Em и Ab части.Полученную серию изображений использовали для построения целостного представления о локализации цветных и неокрашенных клеток с бластоцистой. Используя эти изображения, бластоцисты были классифицированы на три группы в зависимости от углового отклонения линии границы флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости: i) заданные: когда угловое отклонение составляло почти 90 °, ii) полудетифицированные: когда угловое отклонение все еще было <45 °, iii) не указано: когда угловое отклонение было ≥45 °.

Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров

Чтобы понять компетентность сестринских бластомеров в развитии эмбрионов овец, эмбрионы на двухклеточной стадии использовали для разделения и культивирования сестринских бластомеров in vitro, как описано Held et al. (2012) [46]. Вкратце, zona-pelucida 2-клеточных эмбрионов удалялась кратковременной обработкой 0,25% проназой, приготовленной в SOF, забуференном гепатитом (HSOF), в течение 1-2 мин. Сестринские бластомеры разделяли осторожным пипетированием в Hepes-SOF.Отдельные бластомеры, свободные от зон, культивировали индивидуально в микролунках. Вкратце, на дне неклейкой чашки Grainer 35 мм под минеральным маслом готовили каплю 20 мкл mSOF. С помощью стерилизованного самодельного бурильного молотка 12–16 небольших лунок просверливали в два параллельных ряда на пластиковом дне каждой культуральной капли. После уравновешивания соответствующие сестринские бластомеры, полученные из эмбрионов на двухклеточной стадии, помещали индивидуально в параллельные микролунки. Эти бластомеры культивировали еще 8 дней при 39 ° C, 5% O 2 , 6% CO 2 и максимальной влажности.Последующее расщепление и развитие сестринских бластомеров до стадии бластоцисты оценивали на 3-й и 8-й дни соответственно. Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров была классифицирована как: 1) одно дальнейшее расщепление (2-клеточный блок: 2CB), 2) два дополнительных расщепления (4-клеточный блок: 4CB), 3) три дальнейших расщепления (8-клеточный блок). : 8CB), 4) четыре дальнейших расщепления (блок морулы: MB) и те бластомеры, которые достигли стадии бластоцисты (BLS). Тех сестринских бластомеров, которые были остановлены без дальнейшего расщепления после разделения, было немного, и они не были включены в этот эксперимент.

Количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)

Обилие транскриптов 21 гена (таблица 1) сравнивали между пулами трехсекционных фрагментов ооцитов MII; S, NS и FS. Чтобы выбрать гены, мы искали базы данных экспрессии РНК, чтобы найти гены, которые имеют одно обозначение онтологии гена, связанное с плюрипотентностью и дифференцировкой ( SOX2 , NANOG , POU5F1 , FGFR2 , GATA4 , ) CDX Ремоделирование ядра ( NPM2 и GMNN ), импринтинг ( h29 и IGF2R ) и эпигенетическая модификация ДНК или гистона ( PCAF , DNMT3 A, DNMT3 DNMT3 TET1 , TET2 , TET3 , KAT5 , MLL1 , PCAF и STELLA ). Процедура RT-qPCR была описана ранее [47]. Вкратце, суммарную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) с последующей обработкой ДНКазой-I (Ambion, Streetsville, ON, Canada) в соответствии с протоколом производителя. Качество и количество РНК определяли на спектрофотометре WPA Biowave (Кембридж, Великобритания). Для обратной транскрипции 10 мкл общей РНК использовали в конечном объеме 20 мл реакции, содержащей 1 мкл Random Hexamer, 4 мкл буфера RT (10X), 2 мкл dNTP, 1 мкл ингибитора РНКазы (20 IU) и 1 мкл обратной транскриптазы (Fermentas, Glen Burnie, Онтарио, Канада).Обратную транскрипцию проводили при 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C в течение 1 часа и 70 ° C в течение 10 минут. Мастер-микс был приготовлен с использованием 1 мкл кДНК (50 нг), 5 мкл SYBR Green / 0,2 мкл основной смеси ROX qPCR (2X) (Fermentas, Германия) и 1 мкл прямого и обратного праймеров (5 пМ), доведенных до общий объем 10 мкл с использованием воды без нуклеаз. Для каждого праймера проводили три технических повтора RT-qPCR. Образцы CT каждого гена-мишени были нормализованы к CT GAPDH (из-за его стабильной экспрессии между группами) и представлены как 2 -ΔΔCT [48].Последовательности праймеров, температуры отжига и размер амплифицированных продуктов показаны в таблице 1.

Анализ целостности РНК

Для оценки целостности общей РНК аликвоты образцов РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. На этой схеме, прогон интактной тотальной РНК на денатурирующем геле имел четкие и четкие полосы 28S и 18S рРНК.

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Перед любым статистическим анализом оценивалась нормальность данных.Данные в процентах были преобразованы с помощью ArcSin и проанализированы с помощью модели одностороннего дисперсионного анализа SPSS версии 17 (SPSS, Science, Чикаго, Иллинойс, США). Различия сравнивали с помощью апостериорного критерия множественного сравнения Тьюки. Все данные выражены как среднее ± S. E.M. и различия считались достоверными при P <0,05.

Результаты

Оплодотворяющая сперма поступает преимущественно через половину мейотического веретена в ооциты овцы

Топологическая взаимосвязь между мейотическим веретеном и SEP суммирована на Рис. 4.Всего 211 моносперматических зигот использовали для оценки SEP в трех повторностях. Процент зигот, показывающих SEP в мейотической и немейотической половинах, составлял 74,9% (n = 158) и 25,1% (n = 53), соответственно. Важно отметить, что распределение SEP в мейотической половине не было случайным, поскольку какой-либо (0%) SEP наблюдался в зоне-I (~ 16,8% от общей площади ооцитов, которая является ближайшей к мейотическому веретену). Доля SEP в зоне-II (вторая ~ 16,8% от общей площади ооцитов, ближайшая к мейотическому веретену) была значительно выше, чем в зоне-III (69.6 против 40,4% соответственно).

Рис. 4. Топологическая оценка точки входа сперматозоидов (SEP) в яйцеклетке овец.

Оплодотворенные ооциты вращали под постоянным УФ-светом до тех пор, пока веретено MII не установилось на 3 часа. Затем было измерено пространственное соотношение между SEP и MII-веретеном в 4 воображаемых зонах ооцитов. На этой схеме зоны I и IV являются ближайшими и наиболее удаленными от шпинделя MII соответственно. В таблице представлены результаты топологической оценки SEP.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0148382.g004

Некоторые материнские мРНК асимметрично распределены в MII-ооците овцы

Пространственный градиент материнской мРНК сравнивали между объединенными фрагментами ооцитов S, NS, FS, которые были получены микрохирургическим трисекцией 450 неоплодотворенных овоцитов MII в трех повторностях. Как показано на рис.5, общее содержание мРНК объединенных субструктур FS (11,6 ± 2,1 нг / мкл) было сопоставимо с кумулятивным содержанием мРНК NS (6,5 ± 1,1 нг / мкл) + S (5.6 ± 0,9 нг / мкл) -структуры. Общее содержание мРНК S-фрагмента ооцита было значительно ниже, чем у FS, но NS аналогов. Несмотря на то, что выделенный фрагмент S-ооцита составляет только ~ 2,9% от общего объема ооцита, пропорциональное содержание мРНК в S-субструктурах было оценено в 8 и 14 раз выше, чем в фрагментах NS и FS ооцитов, соответственно.

Количественное сравнение транскриптов между фрагментами ооцитов S, NS и FS (рис. 6) показало, что из 21 проанализированного транскрипта 12 (57%) и 9 (43%) показали асимметричное и симметричное распределение внутри MII-ооцита, соответственно (рис. 2А и 6).Основываясь на паттернах регионализации внутри MII-ооцита, эти транскрипты можно отнести к тем транскриптам, которые: i) более многочисленны в S по сравнению с аналогами NS или FS ( NPM2 , GMNN , h29 , PCAF , DNMT3a , DNMT1 и STELLA ), ii) более распространены в NS по сравнению с аналогами S или FS ( SOX2 , NANOG , POU5F1 и TET1 ) в изобилии в FS по сравнению с NS или S аналогами ( GCN ), и iv) равномерно распределены по ооциту ( FGFR2 , NML1 , CDX2 , TIP60 , DNMT3B , IGF2 GATA4 , TET2 и TET3 ).

Для оценки целостности общей РНК аликвоту каждого образца РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Интактная общая РНК, нанесенная на денатурирующий гель, будет иметь четкие, четкие полосы 28S и 18S рРНК, что указывает на качество РНК (S1 фиг.).

Сестринские бластомеры 3-клеточных эмбрионов не наследуют асимметричные транскрипты MII-ооцитов у овец

Поскольку 12 транскриптов показали асимметричную регионализацию внутри MII-ооцита, мы хотели знать, может ли такая же модель асимметрии быть унаследована результирующими эмбрионами.Учитывая, что один бластомер двухклеточного эмбриона расщепляется первым, неизбирательное разделение двухклеточных эмбрионов приводит к ограничениям, исключающим возможность того, что асимметрия транскриптома внутри MII-ооцита приводит к запрограммированному наследованию асимметричного транскриптома между бластомерами двухклеточных эмбрионов [4] (пожалуйста, см. рис. 7). Чтобы избежать этого нежелательного смещения, RT-qPCR выполняли между сестринскими бластомерами второго расщепления и оставшимся бластомером первого расщепления (фиг. 2B). Из 12 проанализированных транскриптов 9 (75%) транскриптов ( H 19, PCAF , DNMT3A , DNMT1 , STELLA , SOX2 , NANOG , TOU5 и показали сравнимую численность между вторыми митотическими продуктами, что указывает на отсутствие доказательств запрограммированного наследования у ранних эмбрионов овец.Несмотря на это, 3 из 12 транскриптов (25%) были асимметрично распределены между сестринскими бластомерами 3-клеточных эмбрионов. Транскрипты NPM2 и GCN были значительно выше по ведущему бластомеру по сравнению с отстающим, тогда как GMNN был значительно выше по отстающему по сравнению с ведущим бластомером.

Рис 7. Важность ориентации эмбриональных отделов.

Расщепление может происходить либо экваториально, либо меридионально, вдоль оси животное-растительность, со ссылкой на веретено MII как гипотетический животный полюс.Результатом экваториального деления первого дробления является асимметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного эмбриона, которая может сохраняться даже после второго деления дробления. Напротив, результатом меридионального деления первого расщепления является симметрия транскриптома между бальстомерами двух- и трехклеточных эмбрионов, несмотря на полярность транскриптов ооцитов. Более того, неразборчивое разделение двухклеточных эмбрионов дает ограничения, которые исключают возможность того, что асимметрия транскриптома внутри MII-ооцита ведет к запрограммированному наследованию асимметричного транскриптома между бластомерами двухклеточных эмбрионов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g007

Суммарные материнские белки асимметрично распределены в MII-ооците у овцы

Спектрофотометрический анализ градиентов белка (рис. 8A) показал, что общее содержание белка в фрагментах ооцитов S, NS и FS было очень схожим (1,98, 1,67 и 1,68 нг / мкл, соответственно). Несмотря на это, общее содержание белка в субструктурах S + NS (3,65 нг / мкл) было в два раза выше, чем в FS. Более того, учитывая тот факт, что фрагмент ооцита S составляет всего около 2. 9% от общего объема ооцита, пропорциональное содержание белка в фрагменте ооцита S можно оценить примерно в 68,3 нг / мкл, что значительно выше соответствующего содержания белка в аналогах NS и FS (3,5 и 3,4 нг / мкл, соответственно).

Рис. 8.

A) Сравнительный анализ содержания общего белка в субклеточных структурах MII-ооцита. a-c : значения с разными верхними индексами значительно различаются при p <0,05. Б) Белковые структуры субструктур ооцитов, выявленные электрофорезом в SDS-PAGE.C) Вестерн-блоттинг NANOG и DNMT3A между фрагментами ооцитов NS + S и FS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g008

Общие лизаты белков субструктур ооцитов были электрофоретически разделены по молекулярной массе с помощью SDS-12% PAGE, и белки визуализировались окрашиванием серебром (рис. 8B). Отсутствие периферического мазка на основном крае геля указывало на то, что большинство окрашиваемых белков ооцитов были разделены во время электрофореза SDS-page. Примечательно, что, несмотря на близкое сходство в белковых структурах трех субструктур ооцитов, наблюдались некоторые количественные или качественные различия в белковых структурах на SDS-геле. Например, интенсивности полос белка 170 и 70 кДа в NS были выше, чем у S и FS.

Специфические материнские белки асимметрично распределены в MII-ооцитах овцы

Чтобы убедиться в специфичности антител, иммуноблоттинг был проведен на тканях овцы (семенники и печень) и фибробластах.Полученные данные показали, что из семи антител (SOX2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1, cKIT, OCT4 и NANOG), проверенных на перекрестную реактивность с соответствующими белками овцы, только антитела DNMT3A, DNMT3B и NANOG реагировали с соответствующими белками овцы. Иммуноблоттинг разделенных пополам ооцитов овцы с этими одобренными антителами показал, что белки DNMT3A и NANOG по-разному локализованы в ооцитах MII овцы (S2 фиг.). Соответственно, половина ооцита рядом с веретеном (NS) содержала более высокие уровни материнских белков DNMT3A и NANOG по сравнению с половиной ооцита, которая была расположена далеко от веретена (FS). Хотя DNMT3B должным образом реагировал с тканями овцы (семенники и печень) и фибробластами, ни с разделенными пополам, ни с интактными ооцитами не было получено белковой полосы (рис. 8C).

SEP может не определять первую плоскость дробления у эмбрионов овец

Чтобы определить, имеет ли SEP какое-либо отношение с первой плоскостью расщепления, SEP был помечен с использованием дили-мечения зоны. Из 68 проанализированных расколотых яиц только в 3 (4,4%) SEP и плоскость дробления перекрывались. В остальных 65 яйцах топологическое положение первой плоскости спайности относительно SEP было вполне стохастическим.Используя другую партию меченых яиц, мы также не смогли различить тенденцию к локализации SEP в конкретной области этого 3-клеточного эмбриона (данные не показаны).

Распределение цитоплазматических липидов относительно симметрично между сестринскими бластомерами ранних эмбрионов овцы

Липид-специфический флуорохром, нильский красный, использовали для пространственного сравнения содержания липидов в ооците (рис. 9, образцы изображений A-A ») и между бластомерами эмбрионов на двухклеточной стадии (31 эмбрион в 3-х повторах).(Рис. 9, образцы изображений B-C »). Первое наблюдение заключалось в том, что относительная средняя интенсивность флуоресценции сильно различалась между разными эмбрионами. Даже несмотря на то, что у 40/45 (88,9%) оцениваемых двухклеточных эмбрионов не было существенной разницы между относительной средней интенсивностью флуоресценции двух бластомеров (0,9 ± 0,2 против 1,3 ± 0,3, условные единицы) (Рис.9, образцы изображений BB »). У оставшихся 5/45 (11,1%) двухклеточных эмбрионов относительная средняя интенсивность флуоресценции одного бластомера была значительно выше, чем другого (0.6 ± 0,3 против 1,5 ± 0,2 условных единиц) (Рис. 9, образцы изображений C-C »).

Рис. 9. Типичные рисунки и окрашивание Нильским красным для исследования распределения липидных капель с MII-ооцитами (A-A «) и между сестринскими бластомерами 2-клеточного эмбриона (B-C»).

Липидные капли равномерно распределены в MII-ооците (A-A «) и в большинстве двухклеточных эмбрионов (A-A» и D). Однако в некоторых двухклеточных эмбрионах один бальстомер имел значительно более высокие липидные капли (C-C ”и E). Полоса соответствует 100 мкм.*: достоверно отличается при P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g009

Внутрицитоплазматическая инъекция Dil не нарушает деление клеток и развитие эмбриона у овец

Было проанализировано влияние инъекции Dil на выживаемость эмбрионов, деление клеток и развитие эмбрионов. Из 245 овечьих 2-клеточных эмбрионов, которым вводили Dil, 32 (13,1%) были обнаружены с лизированными бластомерами. Тем не менее, соответствующий процент успешно помеченных эмбрионов, которые могли развиться до стадии бластоцисты (37.5%) было сравнимо с фиктивной инъекцией (41,3%) и контролем без инъекции (44,3%). Важно отметить, что порядок деления 2-клеточных бластомеров не зависел от метода мечения, поскольку вероятность деления меченых и немеченых бластомеров первыми была сопоставимой (58,2% (124/213) и 41,8% (89/123), соответственно). .

Потомство ведущего бластомера внесло вклад в большее количество клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающим аналогом

Из 213 успешно маркированных эмбрионов овец 80 (37.5%) до бластоцисты. В 10 бластоцистах (12,5%) мы не смогли определить точное распределение клеток, полученных из введенного бластомера. Эта неудача была связана с везикулярностью (отсутствие различимой ICM), которая иногда возникает при продуцировании эмбрионов in vitro у сельскохозяйственных животных [49]. Вклад ведущих и отстающих бластомеров в общее количество клеток сформировавшихся бластоцист был проанализирован на 12 бластоцистах (рис. 10). В большинстве случаев (9/12 = 75,0%) ведущий бластомер вносил вклад в большее количество клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающими бластомерами (в среднем 69.6 против 50,6 соответственно). В оставшихся бластоцистах общий вклад ведущих и отстающих бластомеров в общее количество сформировавшихся бластоцист был сопоставим (в среднем 53,1 против 46,9 соответственно).

Рис. 10. Вклады ведущих и запаздывающих бластомеров в общее количество клеток в развитых бластоцистах.

В большинстве (75%) бластоцист ведущие бластомеры способствовали значительному увеличению количества клеток бластоцисты по сравнению с отстающими аналогами.В остальных 25% вклады ведущих и отстающих бластомеров в общее количество клеток бластоцист были сопоставимы. *: достоверно отличается при P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g010

Порядок дробления эмбрионов овцы на двухклеточной стадии не определяет вклад ведущих и отстающих бластомеров в эмбрионально-эмбриональные части сформировавшихся бластоцист у овцы

Был ли помечен ведущий или отстающий бластомер у двухклеточных эмбрионов, только 3.3% развитых бластоцист имели угол ортогональности между флуоресцентными / нефлуоресцентными клетками и экваториальной плоскостью (заданный образец) (рис. 3, таблица 2). Более того, 8,2% развитых бластоцист представляли собой небольшое отклонение (<45 °) в их угловом градусе (полузаданный образец), соотношение, которое существенно не отличалось по сравнению с ортогональной (определенной) группой. Однако 88,5% развитых бластоцист показали отклонение углового градуса на ≥45 ° (неустановленный рисунок), что было значительно выше, чем в обеих последних группах (рис. 3, табл. 2).

Отслеживание происхождения клонов, происходящих от ведущего бластомера (рис. 3, таблица 2), показало, что ни одна (0%) из развитых бластоцист не может представлять собой ортогональный угол отклонения флуоресцентных / нефлуоресцентных клеток от экваториальной плоскости (заданный образец) и только 12,5% развитых бластоцист были отнесены к полуидентифицированным. Напротив, большинство бластоцист (87,5%) представляли большие отклонения в их угловой степени (неуказанный образец).

Трассировка клонов, полученных из отстающих бластомеров, показала, что 5.4% развитой бластоцисты имели ортогональное угловое отклонение (заданная картина). Интересно, что для всех бластоцист этой категории потомство отстающего бластомера находилось в эмбриональной части, и мы не наблюдали ни одной бластоцисты с абсолютным вкладом отстающего бластомера в TE. Более того, 5,4% эмбрионов были отнесены к категории полузаданных на основании их отклоненного углового вылета. Напротив, большинство бластоцист (91,9%) были классифицированы как неопределенные на основании вклада их отстающих бластомеров в области Em-Ab (рис. 3, таблица 2).

Относительное равенство в развитии соответствующих сестринских бластомеров, полученных из двухклеточных эмбрионов овцы

Всего 456 эмбрионов ЭКО на 2-клеточной стадии из 6 повторов были использованы для разделения сестринских бластомеров. Средняя частота успеха разделения сестринских бластомеров, оцениваемая по возможности получить два неповрежденных бластомера, была довольно высокой (> 93%). Пилотное исследование показало, что развитие in vitro эмбрионов на 2-клеточной стадии без зоны было незначительно ниже, чем у аналогов без зоны (31.5 ± 8,6 против 36,7 ± 5,9% соответственно). На рис.11 показана взаимосвязь между способностью данного бластомера к развитию до определенной стадии развития (ось Y: 2CB, 2-клеточный блок; 4CB, 4-клеточный блок; 8CB, 8-клеточный блок; MB: блок морулы; BLS. , бластоциста) и его сестринского бластомера (ось X: 2CB, 2-клеточный блок; 4CB, 4-клеточный блок; 8CB, 8-клеточный блок; MB: блок морулы; BLS, бластоциста). Как показано, пропорции двухклеточных эмбрионов овец, у которых оба сестринских бластомера прекращали развитие до стадии бластоцисты (2CB, 4CB, 4CB и MB) или достигли стадии бластоцисты (BLS), составляли 35.5, 26,3, 28,5, 46,8 и 39,6% соответственно. Вероятность того, что один сестринский бластомер прекратил развитие до стадии бластоцисты (на стадии 2CB, 4CB, 4CB или MB), в то время как другой сестринский бластомер достиг стадии бластоцисты, составляла 16%. Кумулятивная вероятность того, что один бластомер развил одну или несколько стадий дальше, чем соответствующий сестринский бластомер, составляла 43,9%. Сходным образом, кумулятивная вероятность того, что один бластомер развил одну или несколько стадий раньше, чем соответствующий сестринский бластомер, составляла 36.1%.

Рис. 11. Компетенция развития соответствующих сестринских бластомеров, полученных из двухклеточных эмбрионов овцы.

Доля сестринских бластомеров, которые развились до определенных стадий развития (ось Y: 2-клеточный блок (2CB), два дальнейших расщепления (4-клеточный блок: 4CB), три дальнейших расщепления (8-клеточный блок: 8CB), четыре дальнейших расщепления (блок морулы: MB) и те бластомеры, которые достигли стадии бластоцисты (BLS)). Размер кружков соответствует их относительным пропорциям (числам внутри кружков).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.g011

Discussion

Полярность ооцитов и формирование эмбрионального паттерна — хорошо установленные особенности развития у низших видов [1]. Существуют ли сходные формы предварительного формирования паттерна у млекопитающих, в настоящее время ведутся горячие споры у мышей [50]. У свиней два исследования предоставили доказательства формирования паттерна эмбрионов в связи со смещенным распределением цитоплазматических липидов и митохондрий между 2-клеточными бластомерами [34, 35].Впервые у овец мы предоставили доказательства пространственного распределения общих и специфических транскриптов и белков в неоплодотворенных ооцитах MII. Важно отметить, что направление и ориентация пространственного расположения транскриптов и белков соответствовали положению веретена MII и четко идентифицировали два полушария, относительно сопоставимые с наблюдаемыми ооцитами Xenopus . Анализ оплодотворенных ооцитов также показал явное смещение в предпочтительном месте входа сперматозоидов в MII-ооциты овцы.Эти результаты согласуются с некоторыми исследованиями на мышах [4, 51, 52], что может свидетельствовать о существовании животно-вегетативной оси внутри ооцитов млекопитающих. Тем не менее, не наблюдалось значительной разницы между количеством транскриптов 2-клеточных бластомеров, что указывает на то, что полярность транскрипции неоплодотворенных ооцитов не сохраняется после оплодотворения. Следовательно, необходимо различать возможную временную поляризацию материнских мРНК и белков в неоплодотворенных ооцитах овоцитов и истинную полярность, наблюдаемую в ооцитах более низких видов, таких как ооциты Xenopus [33]. В отличие от гипотезы предварительного формирования паттерна, мы не наблюдали никакой связи между порядком деления 2-клеточных бластомеров и паттерном распределения клеток в ICM и TE бластоцист овцы. Более того, наблюдалось относительное равенство между способностью к развитию данного бластомера двухклеточных эмбрионов и его сестринского бластомера развиваться до определенной стадии развития in vitro. Следовательно, в то время как асимметрия транскриптов и белков внутри неоплодотворенных ооцитов предоставила доказательства в поддержку предварительного формирования паттерна у млекопитающих, отслеживание линеек ранних расщепленных бластомеров предоставило доказательства против этой гипотезы.

Мембранно-растворимый флуоресцентный краситель Dil был использован для отслеживания клеточного происхождения эмбрионов на двухклеточной стадии [9]. Однако для эмбрионов овцы на двухклеточной стадии мы не смогли маркировать эмбрионы путем позиционирования красителя на клеточной мембране. В отличие от мышей, ооциты и эмбрионы копытных животных имеют непрозрачный или темный вид из-за характерного для них большого скопления липидных капель и гранул [34, 35, 40]. Эта обогащенная липидами цитоплазма может препятствовать простому всасыванию растворенного в масле Dil плазматической мембраной.Таким образом, интрацитоплазматическая инъекция Dil использовалась для мечения двухклеточных эмбрионов овцы, что согласуется с исследованием Park et al. [35] у свиней. Полученные результаты показали, что, хотя общая скорость развития инъецированных эмбрионов была ниже, чем у не инъецированных эмбрионов, вероятность деления меченых и немеченых бластомеров первыми была равной, что свидетельствует о том, что порядок деления не зависит от метода маркировки.

В 75% оплодотворенных ооцитов точка входа сперматозоидов располагалась в полушарии мейотического веретена.Этот показатель выше, чем случайный показатель в 50%. Важно отметить, что распределение SEP в MII-половине не было случайным, поскольку любая (0%) головка сперматозоида наблюдалась в зоне-I, которая составляет 16,7% области, ближайшей к мейотическому веретену. Это наблюдение согласуется с исследованиями Hiiragi и Solter [16] и Motosugi et al. [18] у мышей. SEP не был связан с наличием кумулюсных клеток, потому что те же результаты были получены, когда кучево-коронные клетки были диспергированы перед ЭКО (данные не показаны). Таким образом, предпочтительный SEP, наблюдаемый в зиготах овец, напоминает теорию внутренней полярности ооцитов млекопитающих, утвержденную рядом исследователей, включая Gardner et al.[8] и Пиотровска и Зерницка-Гетц [10]. Эти исследователи продемонстрировали, что первая плоскость дробления и ось эмбриона у мышей могут быть определены с учетом расположения 2-pb и SEP. В этой схеме бластомер в 2-клеточном эмбрионе, который наследует SEP, будет делиться раньше, чем др., И вносить вклад преимущественно в клон ICM [10]. Напротив, другие исследователи полагают, что ооциты мышей асимметричны в паттерне распределения цитоплазматических компонентов, и это не дает ключа к разгадке полярности ооцита или предпочтительного SEP [16].Примечательно, что Motosugi et al. [18] продемонстрировали, что 2-pb перемещается в сторону первой плоскости расщепления, и предпочтение SEP по отношению к MII-половине обусловлено пространственной асимметрией перивителлинового пространства под 1-pb. Соответственно, вероятность SEP была по существу случайной после удаления зоны, что свидетельствует об отсутствии наследственного предпочтения SEP в ооцитах мышей [18]. Более того, при вращении эмбриона внутри зоны Kurotaki et al. [26] предоставили доказательства, показывающие, что как граница между двухклеточными бластомерами, так и ось Em-Ab бластоцисты совпадают относительно эллипсоидальной формы zona pelucida.Мы также наблюдали объективный SEP в ооцитах овцы, когда зона была удалена перед ЭКО (данные не показаны), что свидетельствует об отсутствии предпочтительного SEP в ооцитах овцы. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения роли зоны, перивителлинового пространства и SEP в зиготе овец и других видов.

По сравнению с другими видами млекопитающих, ооциты и эмбрионы сельскохозяйственных животных характеризуются высоким содержанием липидов, которые хранятся в основном в виде липидных капель в цитоплазме [53]. Помимо их роли в энергетическом метаболизме во время созревания ооцитов и развития эмбрионов [54], асимметричное распределение липидных капель, как предполагается, участвует в выделении клонов у эмбрионов Sminthopsis macroura [55]. Смещение содержания липидов в эмбрионах свиней на двухклеточной стадии наблюдалось Kim et al. (2012) [34]. Последняя группа продемонстрировала, что бластомеры, возникающие из бластомеров, обогащенных липидами, в 2 раза более склонны к формированию эмбриональной части, чем абэмбриональной части, тогда как вклад более ярких бластомеров (без липидов) был прямо противоположным [34]. Мы наблюдали, что у большинства овечьих эмбрионов на двухклеточной стадии относительные средние интенсивности флуоресценции обоих бластомеров были сопоставимы и только у 11.У 1% эмбрионов наблюдалась значительная систематическая ошибка в распределении липидных капель между двумя бластомерами. Отслеживание клонов бластомеров, обогащенных липидами, и бластомеров без содержания липидов не выявило явной корреляции между содержанием липидов и формированием эмбриональной оси у эмбрионов на двухклеточной стадии овец (данные не показаны). В этом противоречии могут быть замешаны видовые различия.

В то время как регионализация транскриптома является существенным детерминантом полярности у многоклеточных животных [4], один важный вопрос заключается в том, хранятся ли эти генные продукты симметрично по всему ооциту или такая же асимметрия транскриптов ооцитов у низших видов существует в неоплодотворенных яйцах млекопитающих. Чтобы ответить на этот вопрос, мы сравнили количество транскриптов генов, участвующих в плюрипотентности и эпигенетическом репрограммировании между 3 субклеточными структурами, полученными микрохирургическим путем из MII-ооцитов овцы: кортикальный материал, содержащий материал веретена MII (S), и половинки ооцита, которые либо близки к (NS) или дальний (FS) шпиндель MII. Первый подчеркнутый момент заключался в том, что общее содержание мРНК половин FS было значительно выше, чем у NS или S, но вполне сопоставимо с NS + S, что предполагает симметричные градиенты мРНК между двумя половинами MII-ооцита.Несмотря на то, что, поскольку S-компартменты составляют минутный объем (≈2–5% от объема интактного ооцита), пропорциональное количество материнской мРНК, ограниченное S, находится в диапазоне от 10 до 80 раз от FS, что отражает явное смещение в пространственное разделение обогащения материнской мРНК в ассоциации с MII-хромосомами у овец. Интересно, что количественное сравнение обилия транскриптов показало, что компартменты S, NS и FS MII-ооцита имеют различимые профили мРНК. Почти все транскрипты, которые преимущественно присутствовали в S- или NS-компартментах, принадлежали генам, участвующим в эпигенетической регуляции плюрипотентности и импринтинга.Эти результаты совместимы с ролью транскрипционной реорганизации сортировки мРНК как прелюдии к установлению судьбы клетки позже в бластоцисте [4, 7, 56].

Используя микроматричный анализ парных микрохирургических образцов веретена и остатков из ооцитов и зигот мышей, VerMilyea et al. [4] показали, что неоплодотворенные MII-ооциты обладают различимыми профилями. Важно отметить, что они продемонстрировали, что хотя значительная погрешность в профилях транскриптомов зиготы и ассоциированного обогащенного веретеном второго полярного тельца все еще была различима после оплодотворения, такая транскрипционная асимметрия не сохранялась между сестринскими клетками внутри 2 или 3 клеточных эмбрионов.Таким же образом Роберт и др. [57] продемонстрировали, что, хотя содержание транскриптов варьируется как у отдельных эмбрионов, так и у близнецов-бластомеров, для большинства генов не наблюдается последовательной асимметрии. Следовательно, в согласии с этими двумя последними исследованиями, мы наблюдали, что начальная транскрипционная асимметрия, существующая в MII-ооците, может не сохраняться через ранние дробления зиготы и эмбриона. Как асимметрия транскриптома, которую мы наблюдали в MII-ооцитах овцы (это исследование), а также в MII-ооцитах и ​​зиготах мыши [4], могла быть устранена в ходе первого дробления эмбриона? Хотя точный ответ еще предстоит понять, он может быть связан с ориентацией первого и второго эмбриональных отделов, экваториальной или меридиональной, вдоль животно-вегетативной оси со ссылкой на веретено MII как гипотетический животный полюс (рис. 3). .Результатом экваториального деления первого дробления является асимметрия транскриптома между бальстомерами 2-клеточного эмбриона, которая может сохраняться даже после второго деления дробления. Напротив, результатом меридионального деления первого расщепления является симметрия транскриптома между бальстомерами двух- и трехклеточных эмбрионов, несмотря на полярность транскриптов ооцитов.

У низших позвоночных и беспозвоночных полярность эмбриона, которая лежит в основе будущего строения тела, ожидается до оплодотворения по полярному распределению белковых доменов и градиентам их концентрации внутри яйца [58].Также документально подтверждено пространственное распределение белков в животном и растительном полюсах ооцитов / яиц амфибий [59, 60]. Однако млекопитающие, похоже, являются исключением. Например, у мышей ооцит считается «асимметричным», но «неполяризованным» [18]. В том же смысле полярность эмбриона обычно считается установленной после имплантации, а не до / во время оплодотворения [16,18]. Хотя некоторые исследования полагают, что та же самая модель полярности ооцитов амфибий существует у млекопитающих и, следовательно, полярность эмбриона может быть прослежена до организации яйца [51, 61, 52, 62].Пока нет исследований, в которых изучалась бы возможная регионализация общего белка у млекопитающих, за исключением нескольких исследований, которые описывали пространственную перестройку некоторых уникальных белков внутри ооцитов мышей [25, 62]. Мы описали здесь, что материнские белки пространственно распределены внутри неоплодотворенных овоцитов, и они сильно ограничены MII-хромосомами. Важно отметить, что иммуноблоттинг показал, что специфические материнские белки, такие как DNMT3A и NANOG, также были асимметрично обогащены в MII-половине веретена ооцитов.Эти результаты могут предоставить первое предварительное доказательство того, что на ключевые события раннего развития млекопитающих, такие как формирование эмбриональной оси и обязательство первого клона, может влиять запас материнских белков, которые были унаследованы ооцитом до оплодотворения.

Отслеживание происхождения меченых эмбрионов овец продемонстрировало, что, хотя потомство быстрого 2-клеточного бластомера способствовало увеличению количества клеток в развитых бластоцистах по сравнению с отстающими бластомерами, потомство, полученное от ведущего / быстрого и отстающего / медленного бластомера, не имеет специфических судьба и их распределение не определяют эмбрионально-абэмбриональную полярность бластоцисты. Эти данные контрастируют с соответствующими исследованиями на свиньях [34, 35] и мышах [5, 8, 9, 10, 11], но согласуются с некоторыми другими исследованиями на мышах в полевых условиях [12, 13, 15, 16, 17 18]. Важно отметить, что наблюдалось относительное равенство между способностью к развитию данного бластомера 2-клеточного эмбриона и его сестринского бластомера развиваться до определенных стадий развития in vitro (2-клеточный блок, 4-клеточный блок, 8-клеточный блок, блок морулы или бластоциста). В аналогичном исследовании крупного рогатого скота Held et al.[46] показали общий коэффициент корреляции 73% с точки зрения развития in vitro раздельных сестринских бластомеров крупного рогатого скота. Даже несмотря на то, что видоспецифические различия в механизме развития эмбрионов могут помешать прямому сравнению этих исследований, и, следовательно, подразумевается, что каждый вид следует рассматривать отдельно от других видов.

Наиболее важным фактором, влияющим на компетентность ооцитов, является наследие фолликулярной среды до возобновления мейоза, которое обеспечивает полную поддержку во время ранних эмбриональных событий до широкой активации эмбрионального генома [63]. В современной модели оогенеза млекопитающих, однако, этот огромный материнский запас создается внутренне, когда ооцит достигает своего полного размера в фолликуле [64]. Однако совсем недавно Macaulay et al. [65] предоставили доказательства синапсоподобной связи везикулярного транспорта, которая поддерживает избирательный перенос больших молекул, таких как транскрипты, из кумулюсных клеток в полностью выросший ооцит крупного рогатого скота. Принимая во внимание этот неожиданный вклад клеток кумулюса в материнские запасы, было бы интересно узнать, могут ли наблюдаемые полярности транскриптов [4, 57] и белков (это исследование) в ооцитах млекопитающих быть связаны с одинаковыми уровнями функциональной полярности окружающие кучевые клетки.

Классически, после разделения бластомеров эмбриона на двухклеточной стадии, каждый бластомер может часто развиваться до бластоцисты и до термина [66, 6, 15, 29, 67, 68, 69]. Эта высокая степень пластичности развития подтверждает предположение, что раннее эмбриональное развитие у млекопитающих, в отличие от развития других видов, является стохастическим [30]. Знание о пластичности развития, с которой эмбрионы адаптируются к экспериментальным возмущениям, открывает многообещающие возможности для размножения животных со сходным генетическим фоном для исследований, биомедицины и сельского хозяйства.Тем не менее, в более ранних и недавних работах есть указания на то, что отрицание универсальности пластичности развития при условии, что монозиготное сплетение этим методом расщепления эмбриона практически недостижимо [29, 30, 70, 71]. Это может быть объяснено данными о том, что даже если отдельные бластомеры двухклеточного эмбриона могут развиться в бластоцисту, очень небольшое количество беременностей или отсутствие беременности может привести к доношенному рождению монозиготных близнецов этим путем, что свидетельствует о предвзятой компетентности двухклеточного эмбриона в развитии. бластомеры [29, 30].Несмотря на то, что из-за непредвзятого вклада двухклеточных бластомеров овцы, установленного в этом исследовании, и более ранней работы по монозиготному спариванию у овец [67], можно утверждать, что раннее развитие эмбриона у овец, в отличие от низших животных, таких как Xenopus и Drosophila является как стохастическим, так и регуляторным.

Заключение

Насколько нам известно, это исследование является первым, описывающим поляризованное распределение некоторых материнских транскриптов и общих материнских белков в неоплодотворенных ооцитах овцы.Эти находки могут указывать на то, что на некоторые ключевые события раннего развития млекопитающих, такие как формирование эмбриональной оси и обязательство первого клона, может влиять запас материнских белков, которые были унаследованы ооцитом до оплодотворения. Эти результаты могут иметь отношение к низкой компетентности в развитии SCNT-эмбрионов, у которых такой большой источник материнских мРНК и белков удаляется во время энуклеации ооцитов. Более того, может потребоваться уточнение некоторых манипулятивных и диагностических методов.Возможно, например, жизнеспособность эмбрионов после ИКСИ может иметь клиническое значение в зависимости от места инъекции сперматозоидов; при условии, что зрелые ооциты овцы имеют преимущественное проникновение сперматозоидов очень близко к материнским хромосомам, хотя эта тенденция, как было обнаружено, связана с зоной. Несмотря на это, мы наблюдали доказательства симметрии транскрипта и беспристрастного вклада двухклеточных бластомеров в ICM и TE. Более того, наблюдалось относительное равенство между способностью развития данного бластомера двухклеточных эмбрионов и его сестринского бластомера развиваться до определенных стадий развития.Эти данные вместе с другими данными сравнимой компетентности в развитии 2-клеточных бластомеров могут подчеркивать потенциальное использование и клиническую значимость сестринского бластомера раздвоенного 2-клеточного эмбриона для монозиготного спаривания [30, 31], создания аутологичных ESC [30], и прогнозирование компетентности в развитии соответствующего сестринского бластомера [46]. Следовательно, даже если неоплодотворенный ооцит овцы можно считать полярным в отношении пространственной регионализации материнской мРНК и белков, основные силы этой окончательной оси полярности могут не сохраняться во время эмбриональных расщеплений.В этом смысле развитие эмбриона и формирование эмбриональной оси не может быть прослежено до событий до оплодотворения.

Дополнительная информация

S1 Рис. Оценка качества РНК.

Для оценки целостности общей РНК аликвоту каждого образца РНК обрабатывали на денатурирующем агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Прогон интактной тотальной РНК на денатурирующем геле имел четкие, четкие полосы 28S и 18S рРНК, что указывало на качество РНК.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.s001

(TIF)

S2 Рис. Специфичность антител.

Иммуноблоттинг был проведен на тканях (семенники и печень) и фибробластах овцы. Полученные данные показали, что среди семи антител (SOX2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1, cKIT, OCT4 и NANOG) проверена перекрестная реактивность с соответствующими белками овцы. Только антитела DNMT3A, DNMT3B и NANOG реагировали с соответствующими белками овцы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148382.s002

(TIF)

Благодарности

Авторы искренне благодарят С. Остадхоссейни и Ф. Газвини Задеган из отделения эмбриологии Института Рояна за технический вклад в эту работу.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SMH AS MHNE. Проведены эксперименты: SMH FM NTV VA MAD NJ AS HG AHS AVD HRG. Проанализированы данные: СМХ ВА. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MHNE HG. Написал статью: SMH AS MHNE.

Список литературы

  1. 1.
    Эдвардс Р.Г., Борода HK. Полярность ооцитов и определение клеток у ранних эмбрионов млекопитающих. Молекулярная репродукция человека. 1997; 3: 863–905. pmid: 9395264
  2. 2.
    Зерницка-Гетц М, Моррис С.А., Брюс А.В. Принятие твердого решения: многогранная регуляция судьбы клеток раннего эмбриона мыши. Природа Обзоры Генетики. 2009; 10: 467–77. pmid: 19536196
  3. 3.
    Веннекамп С., Мезеке С., Неделек Ф., Хиираги Т. Каркас самоорганизации для нарушения симметрии в эмбрионе млекопитающих.Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2013; 14: 452–9. pmid: 23778971
  4. 4.
    VerMilyea MD, Maneck M, Yoshida N, Blochberger I, Suzuki E, Suzuki T и др. Асимметрия транскриптома внутри зигот мышей, но не между ранними эмбриональными сестринскими бластомерами. Журнал Европейской организации молекулярной биологии. 2011; 30: 1841–51.
  5. 5.
    Гарднер Р. Ранняя бластоциста билатерально симметрична, и ее ось симметрии совпадает с осью зиготы животного-растительного происхождения у мыши.Разработка. 1997; 124: 289–301. pmid:

    06

  6. 6.
    Тарковский А.К. Эксперименты по развитию изолированных бластомеров яиц мышей. Природа. 1959; 184: 1286–7. pmid: 13836947
  7. 7.
    Johnson MH, Ziomek CA. Основа двух различных клеточных линий в моруле мыши. Клетка. 1981; 24: 71–80. pmid: 7237545
  8. 8.
    Гарднер Р. Спецификация осей эмбриона начинается до расщепления при нормальном развитии мыши. Разработка. 2001: 128: 839–47.pmid: 11222139
  9. 9.
    Piotrowska K, Wianny F, Pedersen RA, Zernicka-Goetz M. Бластомеры, возникающие в результате первого деления дробления, имеют различную судьбу в нормальном развитии мышей. Разработка. 2001; 128: 3739–48. pmid: 11585800
  10. 10.
    Пиотровска К., Зерницка-Гетц М. Роль сперматозоидов в формировании пространственного паттерна раннего эмбриона мыши. Природа. 2001; 409: 517–21. pmid: 11206548
  11. 11.
    Зерницка-Гетц М. Характер дробления и возникающая асимметрия эмбриона мыши.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 919–28. pmid: 16341078
  12. 12.
    Аларкон В.Б., Марикава Ю. Отклонение оси бластоцисты от первой плоскости дробления не влияет на качество постимплантационного развития мышей. Биол Репрод. 2003; 69: 1208–12. pmid: 12773417
  13. 13.
    Аларкон В.Б., Марикава Ю. Беспристрастный вклад первых двух бластомеров в развитие бластоцист у мышей. Mol Reprod Dev. 2005; 72: 354–61 PMID: 16078274
  14. 14.
    Аларкон В.Б., Марикава Ю.Пространственное выравнивание оси бластоцисты мышей поперек первой плоскости дробления вызвано скорее механическими ограничениями, чем смещением развития среди бластомеров. Mol Reprod Dev. 2008; 75: 1143–53. pmid: 18196554
  15. 15.
    Chroscicka A, Komorowski S, Maleszewski M. Оба бластомера двухклеточного эмбриона мыши вносят вклад в эмбриональную часть бластоцисты. Mol Reprod Dev. 2004; 68: 308–12. pmid: 15112323
  16. 16.
    Hiiragi T, Solter D. Первая плоскость деления яйца мыши не предопределена, но определяется топологией двух соприкасающихся пронуклеусов.Природа. 2004; 430: 360–4. pmid: 15254539
  17. 17.
    Louvet-Vallée S, Vinot S, Maro B. Митотические веретена и плоскости дробления ориентированы случайным образом в двухклеточном эмбрионе мыши. Curr Biol. 2005; 15: 464–9. pmid: 15753042
  18. 18.
    Motosugi N, Dietrich J-E, Polanski Z, Solter D, Hiiragi T. Космическая асимметрия направляет предпочтительное проникновение сперматозоидов в ооцит мыши при отсутствии полярности. PLoS Biol. 2006; 4 e135. pmid: 16620153
  19. 19.
    Waksmundzka M, Wiśniewska A, Maleszewski M.Распределение клеток в бластоцисте мыши не определяется порядком расщепления первых двух бластомеров. Биол Репрод. 2006; 75: 582–7. pmid: 16822899
  20. 20.
    Нюсслейн-Фольхард К. Определение эмбриональных осей дрозофилы. Разработка. 1991; 113: 1–10.
  21. 21.
    Herr JC, Chertihin O, Digilio L, Jha KN, Vemuganti S, Flickinger CJ. Распределение РНК-связывающего белка MOEP19 в коре ооцитов и ранних эмбрионах указывает на предварительное формирование паттерна, связанное с полярностью бластомера и спецификацией трофэктодермы.Dev Biol. 2008; 314: 300–16. pmid: 18191828
  22. 22.
    Макара И.Г., Мили С. Полярность и различная наследственность — универсальные атрибуты жизни? Клетка. 2008; 135: 801–12. pmid: 1

    46

  23. 23.
    Джонсон MH, нетерпеливый D, Muggleton-Harris A, Grave HM. Мозаицизм в организации рецепторов конканавалина А на поверхностной мембране яйца мыши. Природа. 1975; 257: 321–2. pmid: 1172195
  24. 24.
    Дункан Ф.Е., Мосс С.Б., Шульц Р.М., Уильямс С.Дж.. PAR-3 определяет центральный субдомен кортикального актинового колпачка в яйцах мышей. Dev Biol. 2005; 280: 38–47. pmid: 15766746
  25. 25.
    Antczak M, Van Blerkom J. Влияние ооцитов на раннее развитие: регуляторные белки лептин и STAT3 поляризованы в ооцитах мыши и человека и по-разному распределяются в клетках эмбриона на доимплантационной стадии. Мол Хум Репрод. 1997; 3: 1067–86. pmid: 9464852
  26. 26.
    Kurotaki Y, Hatta K, Nakao K, Nabeshima Y-i, Fujimori T. Ось бластоцисты определяется независимо от раннего клеточного клона, но совпадает с формой ZP.Наука. 2007; 316: 719–23. pmid: 17446354
  27. 27.
    Ван дер Вестерлакен Л.А., Хельмерхорст Ф.М., Херманс Дж., Наактгеборен Н. Внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоидов: положение полярного тела влияет на частоту наступления беременности. Hum Reprod. 1999; 14: 2565–9. pmid: 10527988
  28. 28.
    Мулави Ф., Хоссейни С.М., Хаджиан М., Фоузанфар М., Абеди П., Остадхоссейни С. и др. Метод переноса ядра влияет на количество мРНК, компетентность в развитии и клеточную судьбу реконструированных ооцитов барана. Репродукция. 2013; 145: 345–55. pmid: 23401598
  29. 29.
    Миталипов С.М., Йоман Р.Р., Куо Х.С., Вольф Д.П. Монозиготное спаривание у макак-резусов путем манипуляции с эмбрионами, полученными in vitro. Биол Репрод. 2002; 66: 1449–55. pmid: 11967209
  30. 30.
    Morris SA, Guo Y, Zernicka-Goetz M. Пластичность развития связана с плюрипотентностью и сигнальными путями Fgf и Wnt. Cell Rep.2012; 2: 756–65. pmid: 23041313
  31. 31.
    Taei A, Hassani SN, Eftekhari-Yazdi P, Rezazadeh Valojerdi M, Nokhbatolfoghahai M, et al.Повышенная генерация человеческих эмбриональных стволовых клеток из отдельных бластомеров нормальных и некачественных эмбрионов с дроблением путем ингибирования киназы гликогенсинтазы β и передачи сигналов Rho-ассоциированной киназы. Hum Reprod. 2013; 28: 2661–71. pmid: 23925393
  32. 32.
    Ли Э., Иллингворт П., Уилтон Л., Чемберс Г.М. Клиническая эффективность преимплантационной генетической диагностики анеуплоидии во всех 24 хромосомах (PGD-A): систематический обзор. Hum Reprod. 2014; pii: deu303.
  33. 33.
    Фулька-младший, Карникова Л., Мур Р.М.Полярность ооцитов: ИКСИ, клонирование и родственные методы. Hum Reprod. 1998; 13: 3303–5. pmid: 9886503
  34. 34.
    Kim K, Park S, Roh S. Богатые липидами бластомеры на двухклеточной стадии партенотов свиней демонстрируют предвзятость в отношении вклада в эмбриональную часть. Anim Reprod Sci. 2012; 130: 91–8. pmid: 22277840
  35. 35.
    Park SK, Won C, Choi Y-J, Kang H, Roh S. Ведущий бластомер партеногенетического эмбриона свиньи на двухклеточной стадии сначала вносит вклад в абэмбриональную часть.J Vet Med Sci. 2009; 71: 569–76. pmid: 19498281
  36. 36.
    McMillen IC. Овца — идеальная модель для биомедицинских исследований? Новости ANZCCART. 2001; 14 (2).
  37. 37.
    Барри Дж. С., Энтони Р. В.. Беременная овца как модель беременности человека. Териогенология. 2008; 69: 55–67. pmid: 17976713
  38. 38.
    Хатиб Х. ​​Эпигенетика животноводства. Джон Вили и сыновья. 2012.
  39. 39.
    Хоссейни С.М., Мулави Ф., Хаджиан М., Абеди П., Форузанфар М., Остад-Хоссейни С. и др.Высокоэффективное производство бластоцисты крупного рогатого скота in vitro в бесклеточной последовательной синтетической жидкости яйцевода по сравнению с системой совместного культивирования клеток TCM 199 Vero. IJFS. 2008; 2: 66–73.
  40. 40.
    Хоссейни С.М., Мулави Ф., Асгари В., Ширази А., Абазари-Киа А.Х., Ганаи Х.Р. и др. Простой, быстрый и эффективный метод ручной энуклеации ооцитов с использованием вытянутой пипетки Пастера. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2013; 49: 569–75. pmid: 23824953
  41. 41.
    Шурманн А., Уэллс Д. Н., Обак Б.Ранние зиготы являются подходящими реципиентами для переноса соматических ядер крупного рогатого скота и приводят к клонированию потомства. Репродукция. 2006; 132: 839–48. pmid: 17127744
  42. 42.
    Риенци Л., Убальди Ф., Мартинес Ф., Якобелли М., Минаси М., Ферреро С. и др. Взаимосвязь между расположением мейотического веретена относительно положения полярного тельца и потенциалом развития ооцита после ИКСИ. Hum Reprod. 2003; 18: 1289–93. pmid: 12773461
  43. 43.
    Hardarson T, Lundin K, Hamberger L. Положение веретена метафазы II нельзя предсказать по положению первого полярного тельца в ооците человека.Hum Reprod. 2000; 15: 1372–6. pmid: 10831572
  44. 44.
    Genicot G, Leroy JL, Soom AV, Donnay I. Использование флуоресцентного красителя, нильского красного, для оценки содержания липидов в отдельных ооцитах млекопитающих. Териогенология. 2005; 63: 1181–94. pmid: 15710202
  45. 45.
    Лю З., Хай Т., Дай Х, Чжао Х, Ван И, Брошард В. и др. Раннее формирование паттерна клонированных эмбрионов мыши способствует постимплантационному развитию. Dev Biol. 2012; 368: 304–11. pmid: 22659081
  46. 46.
    Held E, Salilew-Wondim D, Linke M, Zechner U, Rings F, Tesfaye D, et al.Отпечаток транскриптома бластомеров бычьей 2-клеточной стадии напрямую коррелирует с индивидуальной способностью к развитию соответствующего сестринского бластомера. Биол Репрод. 2012; 87: 154. pmid: 23136300
  47. 47.
    Хоссейни С.М., Асгари В., Остадхоссейни С., Хаджиан М., Ганаей Х.Р., Наср-Исфахани М.Х. Компетенция развития яйцеклеток овцы после витрификации: дифференциальные эффекты этапов витрификации, методы продуцирования эмбрионов и родительское происхождение пронуклеусов. Териогенология.2014; 83 (3): 366–76. pmid: 25468553
  48. 48.
    Шмитген Т.Д., Ливак К.Дж. Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C (T). Nat Protoc. 2008; 3: 1101–8. pmid: 18546601
  49. 49.
    Van Soom A, Ysebaert MT, de Kruif A. Взаимосвязь между временем развития, морфологией морулы и распределением клеток по внутренней клеточной массе и трофэктодерме в эмбрионах крупного рогатого скота, продуцированных in vitro. Mol Reprod Dev. 1997; 47: 47–56. pmid: 9110314
  50. 50.
    Хиираги Т., Аларкон В.Б., Фухимори Т., Луве-Валле С., Малешевски М., Марикава Ю. и др.Где мы сейчас находимся? — Встреча по формированию паттерна ранних эмбрионов мышей во Фрайбурге, Германия (2005). Int J Dev Biol. 2006; 50: 581. pmid: 16892171
  51. 51.
    Гарднер Р.Л. Взбитые или разделенные пополам яйца мыши и основа формирования паттерна у млекопитающих. Биологические исследования. 1999; 21: 271–4. pmid: 10377889
  52. 52.
    Цимерих М.А., Меснард Д., Зерницка-Гетц М. Животный и растительный полюсы яйца мыши предсказывают полярность эмбриональной оси, но не являются существенными для развития. Разработка.2000; 127: 3467–74. pmid: 10

    2

  53. 53.
    Гайда Б. Факторы и методы улучшения качества ооцитов и эмбрионов свиней и их применение в репродуктивной биотехнологии. Репрод Биол. 2009; 9: 97–112. pmid: 19734950
  54. 54.
    Кикучи К., Эквалл Х., Тинтай П., Кавай Й., Ногучи Дж., Канеко Х. и др. Морфологические особенности перехода липидных капель при оплодотворении ооцитов свиней и раннем эмбриональном развитии в бластоцисты in vivo и in vitro. Зигота. 2002; 10 (4): 355–66.pmid: 12463532
  55. 55.
    Au PCK, Селвуд Л. , Фамилари М. Клонирование и характеристика нового гена из семейства белков PAT у сумчатого, полосатого дуннарта (Sminthopsis macroura). Mol Reprod Dev. 2010; 77: 373–83. pmid: 20140966
  56. 56.
    Ducibella T, Андерсон Э. Форма клеток и изменения мембран в восьмиклеточном эмбрионе мыши: предпосылки для морфогенеза бластоцисты. Dev Biol. 1975; 47: 45–58. pmid: 173595
  57. 57.
    Робертс Р.М., Катаяма М., Магнусон С.Р., Фалдуто М.Т., Торрес К.Э.Профилирование транскриптов отдельных бластомеров-близнецов, полученных путем разделения мышиных эмбрионов на двухклеточной стадии. Биол Репрод. 2011; 84: 487–94. pmid: 21076082
  58. 58.
    Марлоу Флорида. Материнский контроль за развитием позвоночных: моя мать заставила меня это сделать! Полярность ооцитов и оси эмбрионов: тело Бальбиани, асимметрия древних ооцитов. Сан-Рафаэль (Калифорния): Morgan & Claypool Life Sciences. 2010.
  59. 59.
    Моен Т.Л., Наменвирт М. Распределение растворимых белков вдоль животно-вегетативной оси яиц лягушки. Dev Biol. 1977; 58: 1–10. pmid: 559599
  60. 60.
    Jäckle H, Eagleson GW. Пространственное распределение обильных белков в ооцитах и ​​оплодотворенных яйцах мексиканского аксолотля (Ambystoma mexicanum). Dev Biol. 1980; 75 (2): 492–9. pmid: 7372013
  61. 61.
    Weber RJ, Pedersen RA, Wianny F, Evans MJ, Zernicka-Goetz M. Предполагается полярность эмбриона мыши перед имплантацией. Разработка. 1999; 126: 5591–8. pmid: 10572036
  62. 62.
    Vinot S, Le T, Maro B, Louvet-Vallée S.Два белка PAR6 становятся асимметрично локализованными во время установления полярности в ооцитах мышей. Curr Biol. 2004; 14: 520–5. pmid: 15043819
  63. 63.
    Sirard MA. Факторы, влияющие на транскриптомы ооцитов и эмбрионов. Reprod Domest Anim. 2012; 4: 148–55.
  64. 64.
    Bouniol-Baly C, Hamraoui L, Guibert J, Beaujean N, Szöllösi MS, Debey P. Дифференциальная транскрипционная активность, связанная с конфигурацией хроматина в полностью выращенных ооцитах зародышевых пузырьков мыши. Биол Репрод.1999; 60: 580–7. pmid: 10026102
  65. 65.
    Маколей А.Д., Гилберт I, Кабальеро Дж., Баррето Р., Фурнье Э., Тоссу П. и др. Гаметический синапс: перенос РНК в ооцит крупного рогатого скота. Биол Репрод. 2014; 91 (4) 90. pmid: 25143353
  66. 66.
    Николай Ж.С., Холл Б.В. Эксперименты по развивающимся крысам. II. Развитие изолированных бластомеров и сросшихся яиц. J. Exp. Zool. 1942; 90: 441–59.
  67. 67.
    Willadsen SM. Жизнеспособность ранних стадий дробления, содержащих половину нормального количества бластомеров у овец.J Reprod Fertil. 1980; 59: 357–62. pmid: 7431292
  68. 68.
    Тагава М., Матоба С., Нарита М., Сайто Н., Нагаи Т., Имаи К. Получение монозиготных телят-близнецов с использованием техники разделения бластомеров и системы культивирования «Well of the Well». Териогенология. 2008; 69: 574–82. pmid: 18242681
  69. 69.
    Катаяма М., Эллерсик М.Р., Робертс Р.М. Развитие монозиготных эмбрионов мышей-близнецов от момента разделения бластомеров на двухклеточной стадии до бластоцисты. Биол Репрод.2010; 82: 1237–47. pmid: 20181620
  70. 70.
    Папайоанну В.Э., Эберт К.М. Полуэмбрионы мыши: жизнеспособность и выделение клеток в бластоцисте. Dev Dyn. 1995; 203: 393–8. pmid: 7496031
  71. 71.
    Цунода Ю., Макларен А. Влияние различных процедур на жизнеспособность эмбрионов мышей, содержащих половину нормального количества бластомеров. J Reprod Fertil. 1983; 69: 315–22. pmid: 6887141

Красота | Raincity Parent

Когда я был ребенком, моя мама часами лежала на солнышке и пеклась, пока не приобретала свой любимый оттенок бронзы.

В буфете для нас, детей, была бутылка солнцезащитного крема, но я почти уверен, что она оставалась полной на все мое детство. Я помню запах Coppertone, но хоть убей, я не помню, чтобы НИКОГДА его использовал.

Загар всегда считался «основой» нашего летнего загара, поэтому мы просто вышли, получили ожог, и как только он стал коричневым, мы были готовы пойти до конца лета.

Перенесемся вперед на миллион лет, и к миру добавлены двое моих собственных детей, я бы не осмелился выйти на солнце без солнцезащитного крема!

Самое главное, что я нанесла на кожу в этом сезоне, — это солнцезащитный крем .Поскольку в новостях так много говорится о росте рака кожи, особенно в молодом поколении, я определенно накладываю на себя и, самое главное, на своих детей все хорошее. Я даже начала использовать увлажняющий крем с солнцезащитным кремом на лице. То, что я никогда не делала раньше, потому что ежедневно наносила макияж, содержащий SPF. Теперь, когда я домохозяйка, у меня мало или совсем нет времени, чтобы собраться утром, и давайте посмотрим правде в глаза, которая действительно хочет наносить макияж, когда жарко и душно, только для того, чтобы он растаял В течение дня все, что мне нужно, — это увлажняющий крем со встроенным солнцезащитным кремом.

Cloud Vitamin Cream — это больше, чем солнцезащитный крем, это СУПЕР КРЕМ в моих глазах! Он содержит ретинилпальмитат, форму витамина А, которая содержится в естественных условиях и в высоких концентрациях в эпидермисе вашей кожи. Созданный удостоенным наград дерматологом UBC доктором Гордоном Телфордом, Cloud является первым солнцезащитным кремом для потребителей, блокирующим весь спектр солнечных лучей, в то время как обычные солнцезащитные кремы защищают только от 7% лучей.

Исследования показывают, что он может обратить вспять вызванное солнцем старение, сгладить поверхность вашей кожи в течение нескольких недель, навсегда уменьшить вызванные солнцем коричневые пятна, стимулировать рост коллагена для уменьшения тонких линий и морщин и подтянуть дряблую кожу.После впитывания он становится практически водонепроницаемым, а его мощный солнцезащитный эффект сохраняется до 17 дней.

Cloud Vitamin Cream безопасен для детей, поскольку он не содержит консервантов, отдушек и парабенов.

Если вы хотите приобрести кремы Cloud Vitamin для себя, посетите их веб-сайт: cloudvitamincream.com.

Cloud щедро предоставил Raincity Parent Летний набор для раздачи одному счастливому читателю! В комплекте есть образец крема Cloud Vitamin A и удобный пляжный коврик Cloud, идеально подходящий для солнечных дней. Это розыгрыш действует с 19 по 26 августа 2014 года и открыт только для жителей Канады. Пожалуйста, войдите через ссылку Rafflecopter ниже.

Розыгрыш лотереи

You’re on Mute Ornament Украшения и акценты для дома и быта jodapris.com

© 2021 — Jodapris — IMBS | Все права защищены

Ты на немой орнамент

Возврат или обмен любого заказа в течение 30 дней ❤ 【БЕЗ РИСКА ГАРАНТИЯ】 — Удовлетворение потребностей клиентов является нашей первоочередной задачей. Срок поставки: Общее время доставки — время пошива (обычно 7-10 рабочих дней) плюс время доставки (обычно 3-5 рабочих дней), уведомления покупателей: см. Таблицу размеров и предложения рецензентов — размер варьируется в зависимости от бренда, GG Grand General 20037 Нержавеющая сталь 8-1 / 4 ‘8-1 / 4 дюйма I.Оба доступны для детей от 2-6 лет. Модно и фитнес с плавными линиями и стильным дизайном. Вы на немом орнаменте , Отличная покупка для себя или в качестве подарка на день отца / подарка на день рождения для вашего отца или ваших друзей. если нужно; Сушить в стиральной машине на слабом огне; Разогрейте утюг по мере необходимости, персональное плавучее устройство (PFD) поможет вашему ребенку чувствовать себя комфортно в воде, полностью четкое распространение луча на 300 градусов. инновации и ценность для каждой комнаты дома, где требуются решения по доставке воды.Он имеет прозрачную стеклянную крышку и удобные носики или ручки с каждой стороны, я получаю отзывы от своих местных жителей, а также от постоянных покупателей Etsy, You are on Mute Ornament , или, если вы просто хотите заставить их улыбнуться, — эту забавную открытку ИДЕАЛЬНО,) Прокрутите список фотографий, чтобы увидеть все доступные цвета салфеток и фольги, 5 уникальных и только один доступный, в этой сумке есть внутренний карман на молнии и внутренний карман для телефона. * Стоимость доставки не подлежит возмещению ни при каких обстоятельствах, настенная виниловая наклейка для домашнего декора, художественная наклейка, фитнес-знак, девушка, на внутреннем верхнем крае есть небольшая полоска скола — см. Рис. № 4, Размеры продукта: 12 x 10 x 0, Вы участвуете в Mute Ornament , много для всех на вашем 100-м дне школьного праздника, Бесплатная доставка соответствующих критериям товаров.Размер 80-Длина 0 см-Талия * 2 2 см-Возраст -2 года, Низкочастотная двунаправленная биоволновая вибрационная консистентная смазка; Инфракрасная физиотерапия (например, менструальная боль, максимальная прочность на разрыв: 950 Н / мм², Описание продукта Наша ткань Merino Sport сочетает в себе управление влажностью, YUYOUG Floating Real Rocks Stone Aquarium Water Plant Fish Tank Simulation Aquatic Landscape Decoration с присоской и моховой нитью. Ты в немом орнаменте .

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.