Праймер сушить в лампе: Что такое дегидратор, бондер и праймер, для чего они нужны

Правила использования бондера для ногтей

Бондер (bonder – с англ. «скрепляющий») – клейкое вещество для обеспечения адгезии между ногтями и шеллаком. В состав прозрачной жидкости, напоминающей лак для ногтей, входят спирты, органические растворители, смолы, пластификатор, парафин, полимерный клей, клетчатка. Бондер необходим для качественного маникюра.

Материал обладает следующими преимуществами:

благодаря липкой структуре продукт равномерно распределяется по поверхности ногтя;

обеспечивает максимальную степень прилегания чужеродных поверхностей;

дает сцепление с гель-лаком (из-за свойства 2-х стороннего скотча), служа прослойкой между натуральным и нарощенным ногтями.

Отличия бондера от праймера

Неопытный нейл-мастер может подумать, что бондер и праймер – одинаковые средства, но это не так, хотя они оба и помогают повысить адгезию:

• праймер нужен, чтобы защитить ноготь от воздействия веществ, содержащихся в верхних слоях наносимого маникюра. Средство нужно для создания плёнки, служащей барьером;
• праймер также является грунтовкой и очистителем, убирая жир, грязь и влагу, смещая кислотно-щелочной баланс;
• скорость высыхания праймера невелика, УФ-лампа для этой цели не понадобится.

Если обобщить вышесказанное, то станет ясно, что праймер – это грунтовка, бондер – клей; у первого жидкая консистенция, у второго – гелеобразная; сушка после нанесения праймера проводится естественным путем, после бондера – под УФ-лампой.

После высыхания праймера можно нанести бондер – скрепляющее средство в виде геля. С его помощью приклеивают искусственные материалы, он обеспечивает максимальное прилегание и ровное сцепление. Используя оба средства, вы сможете идеально скрепить материалы для наращивания на натуральных ногтях. При отказе от бондера качество маникюра страдает, материалы быстро отслаиваются, при отсутствии праймера возможны травмы ногтевых пластин в ходе снятия гель-лака. Бондер и праймер нельзя пытаться заменить друг другом, эти средства нужны для комплексного ухода.

Виды и преимущества бондера

Распространены 2 вида бондера: бескислотный и кислотный. При выборе обратите внимание на то, что бескислотное средство подходит для здоровых ногтей. При сильном истощении ногтей химическими процедурами лучше использовать кислотный бондер.

Бескислотное средство (с этилацетатом в составе) широко используется нейл-мастерами для ногтей с нормальной структурой и жирностью, подходит для шеллака, наращивания на типсах, гель-лака. С его помощью можно быстро удалить влагу и жир. Однако от грибковой инфекции оно не защищает, поэтому перед нанесением следует дополнительно протереть ногти антисептическим средством.

Кислотный бондер применяют при наращивании ногтей, для поврежденных и жирных ногтей. Если верхнее покрытие прозрачное, то кислотный бондер не рекомендуется применять, так как после него возникает желтизна. В состав средства входят бутилацетат, метакриловая кислота, этанол.

Дегидратор – отдельная разновидность бондера. Кроме очистительных свойств, он выполняет барьерную функцию, щадяще ухаживает за кутикулой и подходит для людей, страдающих от аллергии.

Популярностью сейчас пользуются бондеры следующих брендов:

1. Orly Nail – быстро сохнущее средство, образует прорезиненный слой.
2. In’Garden – бескислотный бондер с щадящим отношением к ногтям.
3. IBD – липкая основа обеспечит прочную связь геля с естественными ногтями.
4. Infinity от Nubar – без вредных примесей, для любых ногтей.
5. EzFlow (США) – профессиональное средство.
6. CBF (Япония) – гелеобразное средство, применяется при наращивании ногтей.

Не приобретайте дешевый бондер, так как из-за низкого качества материала маникюр будет недолговечным. Аналогов у этого средства нет.

Преимущества применения бондера:

• предотвращается расслаивание;
• создается защита, предохраняющая ноготь от воздействия лака;
• обеспечивается равномерность прилегания поверхностей;
• ноготь обеззараживается и обезжиривается;
• ногтевая пластина прочно соединяется с материалом.

Необходимые инструменты

• Пилочка, средство для удаления кутикулы, ножнички, кусачки, спонж, кисточки
• УФ-лампа
• Антисептик
• Праймер, бондер, базовое покрытие, средства для моделирования ногтей и др.
• Маникюрный пылесос MAX

Последовательность работы

Вначале протирают руки антисептическим средством, кутикулу отодвигают пушером. Чтобы удалить грубую кожицу, используют ножницы с узкими лезвиями или кусачки. Затем ногти шлифуют пилочкой (стеклянной или лазерной). Вы можете не беспокоиться о чистоте воздуха и поверхности стола, если используете маникюрный пылесос MAX – он уловит самые мелкие частички пыли после шлифовки ногтей. На кожу, которая прилегает к области вокруг ногтей, наносят жирный крем. Он послужит защитой от вредных химических веществ. На ногти наносят праймер, распределяя его кисточкой тонким слоем. Он высыхает примерно 1 минуту. Если на ногтях появился налёт, можно наносить бондер. Его накладывают с помощью кисточки тонким слоем, не затрагивая при этом кутикулу. Не допускайте растекания средства, при его попадании на кутикулу нужно будет переделывать работу. Для полимеризации покрытия ногти сушат под УФ-лампой. Теперь можно начать моделирование ногтей на типсах либо формах.

Классический метод использования под гелевые ногти:

• нанесение бондера на ноготь, который покрыт слоем праймера. Кисточку при этом направляют от себя;
• промокание излишков средства спонжем;
• сушка под УФ-лампой 2-3 минуты.

Если бондер используется как клей под типсы, то под лампой его не сушат.

Для шеллака бондер наносится тонким слоем, его рекомендуют втирать кончиком кисточки, а затем спонжем. После сушки ногти станут матовыми. Потом можно нанести шеллак.

Что такое праймер для ногтей и зачем он нужен

Наверняка многие женщины во время процедур маникюра с интересом наблюдали, как мастер наносит на их ногти бесцветную жидкость. Когда клиентка интересуется, что это за жидкость, обычно следует короткий ответ: «Это праймер». Рассмотрим, какие свойства праймера для ногтей, и с какой целью его применяют нейл-мастера.

Особенности средства

Чтобы понять, что такое праймер для ногтей, нужно обратиться к его английскому происхождению. В переводе оно обозначает «грунтовка». Средство усиливает сцепление поверхностей, что необходимо для долговечного покрытия лаком.

Обладая жидкой консистенцией, праймер не создает заметного слоя покрытия. Его не надо сушить в лампе, поскольку он в течение минуты высыхает сам. Еще одно преимущество – возможность нанесения на торцевых гранях и по краям ногтя, именно в тех местах, где чаще всего бывают сколы. При его использовании маникюр держится продолжительное время. Вот для чего нужен праймер для ногтей – создать основу для нанесения декоративного покрытия.

Виды средств и их отличия

Сегодня в специализированных магазинах представлены две разновидности этих составов – кислотные и бескислотные. Рассмотрим, зачем нужен праймер для ногтей разных типов.

Бескислотные

Такие составы оставляют на ногтях липкий слой, гарантирующий крепкую сцепку покрывающих материалов. Он состоит из компонентов, которые на время меняют рН вашего ногтя, приближая его к показателю щелочного покрытия. Благодаря этому декоративный слой прочно «приклеивается» к ногтю и держится значительно дольше.

Средство не дезинфицирует ногтевые пластины и не удаляет с них избыточную влагу. По этой причине опытные мастера иногда могут использовать его в сочетании с другими средствами, такими как обезжириватель, дезинфектор, дегидратор.

Дезинфектор очищает ногти от грибков, бактерий, различных микробов. Опытные мастера рекомендуют выбирать праймер, не требующий сушки под лампой.

Кислотные

Средства состоят преимущественно из метакриловой кислоты (70-100%). Она протравливает ноготь, кератиновые чешуйки приподнимаются, и состав проникает в его глубокие слои. Если наносить кислотный праймер, то лак или гель прочнее закрепляется на чешуйках. Адгезия становится еще более надежной, а длительность сохранения покрытия увеличивается даже на влажных ногтях.

Кислотные составы мастера стараются применять только при наличии гипергидроза (избыточной потливости, из-за чего ногти постоянно влажные) или при наращивании.

Состав этих видов праймеров отличается наличием или отсутствием в них метакриловой кислоты. Как правило, все эти средства обладают гипоаллергенными свойствами.

Чем отличается база от праймера

База и праймер – не одно и то же. База – это полноценное трехкомпонентное покрытие с липким верхним слоем, блеском и слоем, который сушат УФ-лампой. Праймер же применяют для подготовки ногтя.

Если праймером необходимо обязательно пользоваться, базу рекомендуется применять лишь в тех случаях, когда предполагается наносить однофазные гель-лаки. В противном случае маникюр будет не столь долговечным, как хотелось бы.

Есть ли разница между бондером, бондом и праймером

Прежде чем выбирать праймер, следует учесть, что разные фирмы выпускают его под различными названиями. К примеру, у InGarden он называется Bonder, у Nail Club – Bond Primer. Такая путаница произошла из-за того, что праймеры претерпели изменения в ходе развития ногтевой индустрии.

Вначале компании, его производящие, представили гелевый состав. Он предназначался для подготовки пластин к нанесению базы. Состав с плотной текстурой необходимо было сушить в лампе.

Через некоторое время начали делать жидкое средство. При его применении искусственное покрытие не выглядело слишком толстым. Его назвали «бонд» («связка»). Однако некоторые компании прежнее название – «праймер» – не стали менять.

Чтобы не ошибиться и приобрести хороший праймер для ногтей, когда вы покупаете продукт в магазине или заказываете на сайте, внимательно ознакомьтесь с этикеткой. Если на флаконе указано «no acid», то это качественный бескислотный праймер.

Чем заменить специальное средство

Вместо праймера можно попробовать использовать аналоги. Судя по отзывам, они действуют не менее эффективно:

1. Не столь агрессивный бонд. Этот препарат считается более щадящим: негативного воздействия на натуральный ноготь он не оказывает.
2. Духи или одеколон. Такие подручные средства способны эффективно обезжирить ногтевые пластины благодаря содержанию спирта.
3. Обычная жидкость для снятия лака либо ацетон уберут загрязнения с ногтевой пластины и подготовят ее к нанесению декоративного покрытия.
4. Обезжирить и обеззаразить ноготь может и обычный пищевой 6% уксус.
5. Дешевая альтернатива специальному праймеру – борная кислота.

Как использовать праймер для ногтей самостоятельно

Мастера подготовили рекомендации по поводу того, как наносить праймер на ногти:

1. Пушером или деревянной палочкой отодвиньте от ногтевой пластины кутикулу.
2. Шлифовальной пилочкой удалите натуральный блеск.
3. Теперь пришло время нанести праймер. В вопросе, как использовать праймер для ногтей правильно, главное – не перестараться с количеством. Его необходимо набирать на кисть немного. Приложите кисточку к центру ногтя. Дайте составу распространиться по пластине, слегка распределяя его таким образом, чтобы он не контактировал с кожей. Средство должно быть нанесено тонким слоем.
4. После этого наносите материал для наращивания либо укрепления ногтя.

Что такое праймер для ногтей (ультрабонд) и для чего он нужен

Девушку украшает не скромность, а аккуратный, красивый маникюр. Именно он придает ее образу завершенность, именно он является главным индикатором ухоженности представительницы слабого пола. Для того, чтобы наслаждаться роскошным маникюром как можно более долгий период времени, мастера ногтевого сервиса перед нанесением покрытия используют специализированный праймер. Данное средство не просто продлевает стойкость любого замысловатого дизайна, но и служит своеобразным барьером, защищающим маникюр. Всю информацию о том, как выбрать, где купить и как использовать праймер для ногтей предоставили эксперты ProstoNail.

Праймер для ногтей – что это такое и нужен ли он

Праймер для ногтей, совсем как многоликий Янус, имеет тысячу и одно название, что вводит в заблуждение и без того озадаченных девушек. Иногда его именуют бонд, ультрабонд или бондер, иногда — преп, иногда — дегидратор или обезжириватель, а порою праймер нарекают «двусторонним скотчем». Что общего между этими двумя материалами? Праймер и скотч выполняют схожий функционал — крепят либо же приклеивают один предмет к другому.

В принципе, если вы хоть немножко интересуетесь макияжем, то слово «праймер» не станет для вас диковинкой. Ведь профессиональные визажисты используют базу для продления стойкости мейкапа. С английского праймер переводится буквально как «грунтовка для ногтей», что предельно точно отображает базисную задачу средства — очистить, обезжирить и улучшить адгезивную способность натуральных ногтевых пластин. В отличие от классической базы, применяемой в домашних условиях, праймер не создает дополнительный слой на ногтях, а буквально поглощается ими, аналогично как и грунтовка, нанесенная на стены во время ремонтных работ.

Теперь, когда вы знаете что это за «явление», пора уяснить некоторые особенности использования праймера и понять, для чего нужен столь популярный нынче атрибут, преображающий маникюр.

Для чего нужен праймер для ногтей

Бонд для ногтей — наипервейший и важный этап в манипуляциях с ноготками, который стоит учитывать, если вы решили сделать искусственное наращивание ногтей или их укрепление гелем. Под термином «искусственное наращивание ногтей» профи подразумевают не только непосредственно процесс накладывания акрилового или гелевого материала с целью поменять форму или длину ноготков, но и любые другие манипуляции, каким-либо образом изменяющие внешний вид ногтей, куда можно отнести даже выполнение неил-арта или дизайна.

Возникает логичный вопрос — зачем нужен праймер для ногтей и как он работает? Ведь в домашнем маникюре мы, как правило, упускаем этот шаг, приступая к нанесению лака. Следуя мнению различных экспертов праймер:

• продлевает стойкость маникюра. Особенно на местах частых сколов и отслоения акрила или геля, а именно на боковых частях свободного края, а также возле кутикулы;
• структура натуральных ноготков предельно гладкая и ровная, особенно, если перед этим к пальчикам применяли шлифовочный баф. Задача праймера — несколько «разрыхлить» пластину, приподняв кутикулы для лучшего сцепления акрила и натурального ноготка;
• результаты адгезии (этого самого сцепления поверхностей) зависят от взаимодействия между химическим составом натурального ногтя, его состояния и химического состава продукта;
• каждая часть нашего тела, покрытая кожей или ороговевшим слоем, которым и являются ногти, имеет свой pH. Для того, чтобы искусственное щелочное покрытие как можно лучше сцепилось с натуральным, нужно повысить показатели pH у натуральных ногтей. Такой компонент и является основой состава химических праймеров, правда, изменение баланса pH все равно явление временное и по истечению сугубо индивидуальных сроков щелочной баланс все равно приходит в норму.

Как видите, праймер для маникюра играет ряд важных функций, улучшая качество покрытия и продлевая его стойкость. Так почему бы не поэкспериментировать со столь полезным материалом?

Чем отличается праймер от базы для ногтей

Любительницы макияжа не понаслышке знают, что такое праймер для лица. Он сглаживает поры и заполняет их, выравнивает общий рельеф и матирует либо же увлажняет в зависимости от типа вашего эпидермиса. Конечно же, праймер и основа для визажистов — неразделимые понятия и абсолютнейшие синонимы. Но так ли дела обстоят в сфере ногтевого сервиса?

Мастера маникюра, как никто другой, знают, что праймер и основа — два категорически разных материала. Сейчас их основные отличия будут пояснены и вам:

• база для ногтей практически всегда выглядит как стандартный, прозрачный, в меру густой лак. Она наносится перед цветным покрытием и заполняет собою все неровности, улучшая сцепление искусственного геля с натуральной ногтевой пластиной. По сути, это промежуточный слой, ощутимый в процессе маникюра. Он дополнительно утолщает ноготки и иногда может приносить ряд дискомфортных ощущений, особенно если нивелировать технологией нанесения;
• праймер же — это, как правило, жидкое средство, которое очищает, обезжиривает, подсушивает ногтевую пластину. Оно не остается на ногтях отдельным покрытием. Если только речь не идет о специальной базе с функцией «грунтовки». Она обычно немного более плотная и тягучая, и ее нужно сушить под светом УФ-лампы. Слой такой базы улучшает сцепление с искусственным покрытием и, одновременно с этим, защищает ноготь от воздействия химических компонентов «сверху». Так что чаще всего «грунтовку» наносят при маникюре гель-лаком и при наращивании ногтей.

Дабы разграничить сферу применения праймера и базы стоит запомнить несколько простых и банальных моментов:

• база для ногтей — обязательный шаг в выполнении маникюра, вне зависимости от того, простым или гелевым лаком вы осуществляете данные манипуляции. В то время как праймер — средство, используемое чаще всего профессионалами для улучшения показателей адгезии, а с ними и стойкости маникюра;
• отправляясь в хороший салон, будьте уверены, что там на ваши ноготки обязательно нанесут ультрабонд коди или любой другой из популярных экземпляров в данном сегменте. При маникюре, делаемом новичком, праймер использоваться не будет;
• наиболее ярким отличием можно считать консистенцию средств. У праймера она предельно жидкая, практически как вода. У стандартных баз консистенция тягучая и в меру густая, вязкая и тянущаяся за синтетической кистью;
• также разница наблюдается и в функционале продуктов: праймер стандартно улучшает показатели адегзии, работая, как двусторонний скотч. Но также он защищает пластины от негативного влияния внешней среды: перепадов температур, бытовой химии, жесткой водопроводной воды, ультрафиолета и механических повреждений. Задача базы несколько отличается, ведь это физически ощутимый, промежуточный слой. Полноценное покрытие, выравнивающее поверхность ногтей и придающее им гладкость;
• база необходима для всех видов маникюра. Праймер же используют преимущественно при наращивании ногтей, отделяя их поверхность от плотной текстуры геля.

Праймер и обезжириватель для ногтей – есть ли разница?

Наращивание ногтей — процесс долгий и кропотливый, требующий выдержки клиента и высокого профессионализма мастера. При этом специалист использует ряд инструментов и материалов, среди которых есть праймер. Праймер для наращивания ногтей — обязательный шаг, которым не стоит пренебрегать. В предыдущих пунктах мы уже говорили о том, что праймер имеет тысячу и одно вспомогательное название, среди которых числится и обезжириватель. На самом же деле обезжириватель и дегидратор — одинаковые по функционалу, но различимые по уровню действия препараты.

Обезжириватель работает поверхностно, снимая с липидного ороговевшего слоя ногтевой пластины жир и грязь, накопленные на протяжении «голой» носки. При этом он все так же готовит ноготки к нанесению искусственного материала. И только после обезжиривателя эксперты рекомендуют наносить праймер, работающий уже на более глубинном уровне. Чтобы определиться, какой из этих препаратов необходим в вашем конкретном случае, нужно учитывать некоторые особенности организма. К примеру, если у вас склонность к повышенному потоотделению и жирная кожа, то перед непосредственным наращиванием вам лучше воспользоваться дегидратором. Не имея таких ярко выраженных проблем, вы можете удалить с поверхности натуральной пластины естественные отложения и грязь с помощью обезжиривателя для ногтей.

Дабы окончательно расставить все точки над «і», подробнее рассмотрим состав праймера, определив его разновидности. Глобально можно выделить 2 типа материалов:

• безкислотные праймеры;
• кислотные праймеры.

Кислотный преп более актуальный для девушек с повышенным потоотделением. Хоть его формула и более агрессивна по сравнению с безкислотным аналогом, но она и более эффективна. Активные химические вещества проникают глубоко в ороговевший слой эпидермиса и приподнимают его кератиновые чешуйки, создавая нужную степень шероховатостей. Будьте осторожны при работе с кислотными средствами и не допускайте их попадания на боковые валики, кутикулу или кожу вокруг ногтя, так как преп может спровоцировать аллергическую реакцию либо же ожог. Также дожидайтесь полного высыхания праймера и только тогда приступайте к последующим манипуляциям. Высыхание можно охарактеризовать сухостью и белесым оттенком ноготков.

Безкислотный праймер более щадящий. Его наносят на сухие коготки. Данный препарат максимально бережно и деликатно очищает ногтевую пластину, но не обезжиривает ее, так как не может проникнуть под кератиновую мантию ногтевой пластины. Так как данный продукт не провоцирует ожогов или аллергических реакций, то его могут использовать даже для работы с обладательницами чувствительных ноготков.

Как выбрать праймер для ногтей

Итак, взвесив все «за» и «против» использования ультрабонда, вы таки решились приобрести заветный стеклянный флакончик. Естественно, всех красавиц интересует банальный вопрос — сколько стоит подобное удовольствие и где его можно приобрести? Праймер уже давно перестал быть диковинкой, ведь нынче он продается не только узконаправленных, специализированных магазинах, но и в классических косметических моллах, а также на интернет-площадках. Цена миниатюрного бутылька варьируется от одного доллара до нескольких десятков. Почему она так отличается и как выбрать самый лучший праймер для ногтей? Ответы ищите ниже:

• первый и самый главный фактор, на который стоит обратить свое пристальное внимание — это состав. У кислотного праймера в перечне ингредиентов вы наверняка заметите метакриловую кислоту, на 80% формирующую содержимое. В то время как на флаконе с безкислотным аналогом можно увидеть пометку «non-acid», говорящую о безопасности и лайтовости средства;
• не ведитесь на яркие этикетки и обещания производителей. А также не теряйтесь от многообразия названий. Вы уже знаете основные различия праймера и обезжиривателя, а также праймера и базы, так что успешно приобретете именно тот продукт, который вам нужен для работы;
• мы сделали небольшую подборку брендов, выпускающих хорошие по качеству кислотные бонды. Вот лишь некоторые из них: Runail, IBD, Yoko, TNL, Kodi;
• такая же подборка ждет и привержениц флакончиков с безкислотным содержимым: CND, Bluesky, Runail, EzFlow, Kodi, IBD, Masura, Lechat;
• и, конечно же, внимательно читайте отзывы реальных покупателей, прислушиваясь к критике или комплиментам со стороны.

Как наносить праймер на ногти

Наверняка вам интересно, как пользоваться новинкой в своем арсенале и когда наносить праймер для ногтей. Наша пошаговая инструкция подробно объяснит весь порядок действий, существенно ускорив процесс маникюра:

• изначально совершите стандартную процедуру гигиенического маникюра, придав форму и длину свободному краю ногтевых пластин;
• уделите внимание кутикуле, смягчив ее ремувером, а после либо же просто отодвинув апельсиновой палочкой, либо же удалив, используя ножницы для кутикулы;
• отполируйте ноготки бафом, абразивность которого будет не менее 220 грит;
• самое время обезжирить коготки дегидратором, убрав с их поверхности пыль, грязь, бактерии и излишек себума;
• тонким слоем нанесите праймер, особенно тщательно прорабатывая уголки и края ногтей;
• после того, как праймер впитался продолжите стандартные шаги по наращиванию или нанесению цветного акрилового покрытия.

Чем можно заменить праймер для ногтей

В зависимости от состояния ваших ногтей, мы определяем то, сколько вам потребуется продукта и когда наносить праймер для ногтей. Если вы «счастливая» обладательница «влажных» ногтей, то возможно кислотный праймер нужно будут нанести в два слоя. Если же ваши ногтевые пластины безпроблемные, то бонд можно выбрать безкислотный.

К слову, не у каждой красавицы в арсенале есть флакончик с препом, благо, эксперты ProstoNail, знают, как его заменить, дабы не отказывать себе в удовольствии свеженького покрытия. Так, хорошей альтернативой классическому праймеру станут медицинский спирт или маленькая толика косметического ацетона. Неплохо справляется с подобными задачами также пищевой уксус. Главное, помните, что функциональный бондер слабо заменят обычные продукты «из-под руки», поэтому морально подготовьте себя к весьма заурядной стойкости искусственного материала.

Можно ли обойтись без праймера?

Ответ очевиден — конечно же, да. Кислотные или безкислотные праймеры чаще всего используются в дорогих салонах красоты или студиях маникюра, но в ритуале домашнего моделирования ими можно смело пренебречь. Естественно, если вы не собираетесь самостоятельно наращивать хищные коготки, что изначально является весьма сомнительной затеей.

Используйте праймеры и наслаждайтесь безупречностью своего маникюра максимально длительный период времени, собирая комплименты и коллекционируя завистливые взгляды.

Гель-лак дома: пошаговая инструкция — MAKEUP

Стойкость, яркие оттенки и даже легкость в нанесении. Да, все это о гель-лаке. И благодаря этим преимуществам многие красотки уже не представляют маникюр без использования шеллака. Еще несколько лет назад такая процедура была возможной по умолчанию исключительно в салоне. Но сегодня довольно легко и относительно быстро все можно сделать самостоятельно в домашних условиях. MAKEUPSTORE разложил по полочкам все нюансы нанесения и снятия гель-лака.

Содержание:

Что нужно для маникюра гель-лаком в домашних условиях?

Главное в любых бьюти-процедурах — выверенные движения, а также наличие всех средств и инструментов. Самое важное приспособление — лампа. Именно она обеспечивает быструю и надежную сушку гель-лака. При выборе UV- или LED-лaмпы ориентируйтесь на технические характеристики. На первом месте — мощность. Она должна составлять не менее 36 Ватт. Для домашних манипуляций с гель-лаком необходимы обезжириватель, праймер, база, цветное покрытие и топ. Если вы любите эксперименты, вам не обойтись без декоративных элементов. Яркие, блестящие и оригинальные стразы, пайетки, блестки, наклейки, камифубуки вмиг преобразят маникюр.

Маникюр гель-лаком поэтапно

Шаг №1. Подготовьте ногти

Все манипуляции зависят от ваших предпочтений: любительницам обрезного маникюра понадобится классический набор с кусачками, ножницами и пилочкой, а поклонницам необрезного — специальная жидкость для удаления кутикулы и апельсиновые палочки. Подготовительные работы одинаковы: откорректировать форму пилочкой, удалить/отодвинуть нежную кожицу и отполировать бафом поверхность ногтей.

Шаг №2. Обезжирьте ногти

Протрите ногтевые пластины салфеткой, смоченной обезжиривающим средством. Если его нет, не расстраивайтесь. Отличные бюджетные аналоги — обычный спирт или жидкость для снятия лака.

Шаг №3. Нанесите праймер

Праймер сделает ногтевые пластины идеально гладкими, защитит их от негативного воздействия химических компонентов, запечатает торцы и усилит адгезию (сцепление искусственного покрытия с ногтями). Поскольку консистенция довольно плотная, средство нужно сушить под светом лампы.

Шаг №4. Нанесите базу

Не дольше чем через 15 минут нанесите базу. Да, праймер и база в маникюрном искусстве — это два разных продукта. По консистенции последняя напоминает прозрачный лак. Она готовит ногти к нанесению цветного покрытия: выравнивает неровности и заполняет трещинки. Нанесите ее максимально тонким слоем на четыре пальца, высушите в лампе, а только потом приступайте к работе с большим пальцем. Если вы нанесете покрытие одновременно, то лак просто стечет в одну сторону.

Шаг №5. Нанесите цветное покрытие

Выбрали идеальный цвет? Нанесите сначала тонкий слой, просушите в лампе 45 секунд (кстати, точное время всегда зависит от мощности агрегата). Затем следует второй слой, время сушки которого составляет не более 2-х минут. Чтобы цвет распределился равномерно, красьте сначала четыре пальца, а потом покрывайте ноготь на большом. Два слоя обеспечивают яркость и насыщенность оттенка.

Шаг №6. Нанесите декоративные элементы

Все украшения и рисунки нужно нанести до финишного покрытия. Чтобы прикрепить декор, используйте деревянную палочку, а для создания миниатюрных рисунков — металлические инструменты и кисточку. Этот процесс освоит каждая женщина: окуните палочку в прозрачный лак, легко захватите кончиком аксессуар и прикрепите его на поверхность ногтевой пластины.

Шаг №7. Нанесите финишное покрытие

Финиш (известен также как топ и закрепитель) наносится довольно плотным слоем с обязательным запечатыванием торцов, проведя по ним кисточкой. Именно это средство обеспечивает глянцевый оттенок и безупречный вид в течение 10-14 дней. Идеальный вариант — два слоя топа, каждый из которых нужно просушить в среднем 2-3 минуты. Дегидратор (обезжириватель) и безворсовая салфетка — незаменимый дуэт для удаления липкости. При желании можно выбрать матовый финиш или топ без дисперсионного слоя.

Ваш маникюр готов! Последний штрих — приятный бонус и бережный уход, которого вы заслуживаете. Питание и увлажнение — простой рецепт красивой ухоженной кожи. Поэтому нанесите масло для кутикулы на основание ногтей и деликатно его втирайте.

Как удалить гель-лак в домашних условиях?

Красивый аккуратный маникюр, да еще и самостоятельно, — прекрасный повод для гордости. Но помните: впереди вас ожидает процесс снятия гель-лака. Для этого вам необходимы фольга, средство для удаления шеллака и ватные диски. Последние разрежьте на миниатюрные треугольнички, смочите их, приложите к лаку и оберните фольгой (это предупредит испарение жидкости). Через 15 минут снимите конструкцию, а для удаления остатков цветного покрытия используйте апельсиновую палочку. Если вы не ограничены в бюджете и времени на обучение, используйте профессиональный маникюрный фрезер, с которым процедура снятия гель-лака будет менее травматичной для ногтей.

Вот и все! Уверены, вы легко справитесь с непростым, только на первый взгляд, процессом покрытия ногтей и удаления гель-лака в домашних условиях.

thematistore.com || Elite99 10 мл Fast Air Dry Primer UV LED Gel Base Primer Нет необходимости в УФ / светодиодной лампе Soak Off Гель-лак для ногтей для дизайна ногтей

ОТПРАВКА И ДОСТАВКА

Мы гордимся тем, что предлагаем услуги международной доставки, которые в настоящее время осуществляются в более чем 200 странах и островах по всему миру. Ничто не значит для нас больше, чем предоставление нашим клиентам отличных услуг и услуг. Мы продолжим расти, чтобы удовлетворять потребности всех наших клиентов, предоставляя услуги, превосходящие все ожидания, в любой точке мира.

Как вы отправляете посылки?

посылок с нашего склада в Китае будут отправлены ePacket или EMS в зависимости от веса и размера товара. Пакеты, отправленные со склада в США, доставляются через USPS.

Вы осуществляете доставку по всему миру?

Да. Мы осуществляем бесплатную доставку в более чем 200 стран мира. Однако в некоторые места мы не можем отправить товар. Если вы находитесь в одной из этих стран, мы свяжемся с вами.

А как насчет таможни?

Мы не несем ответственности за любые таможенные сборы после отправки товара.Приобретая наши продукты, вы соглашаетесь с тем, что одна или несколько посылок могут быть отправлены вам и могут получить таможенные сборы по прибытии в вашу страну.

Сколько времени занимает доставка?

Время доставки зависит от местоположения. Это наши оценки:

* Это без учета 2–5-дневного времени обработки.

Предоставляете ли вы информацию для отслеживания?

Да, как только ваш заказ будет отправлен, вы получите электронное письмо с информацией для отслеживания. Если вы не получили информацию об отслеживании в течение 5 дней, свяжитесь с нами.

По моему запросу «на данный момент информации нет».

Некоторым транспортным компаниям требуется 2-5 рабочих дней для обновления информации об отслеживании в системе. Если ваш заказ был размещен более 5 рабочих дней назад, а по вашему номеру отслеживания по-прежнему нет информации, свяжитесь с нами.

Будут ли мои товары отправлены одной посылкой?

По причинам логистики товары в одной покупке иногда отправляются отдельными посылками, даже если вы указали комбинированную доставку.

Если у вас есть другие вопросы, свяжитесь с нами, и мы сделаем все возможное, чтобы помочь вам.

ПОЛИТИКА ВОЗВРАТА И ВОЗВРАТА

Отмена заказа

Все заказы могут быть отменены до тех пор, пока они не будут отправлены. Если ваш заказ был оплачен и вам необходимо внести изменения или отменить заказ, вы должны связаться с нами в течение 12 часов.После того, как процесс упаковки и доставки начался, его уже нельзя отменить.

Возврат

Ваше удовлетворение — наш приоритет №1. Следовательно, вы можете запросить возврат или повторную отправку заказанных товаров, если:

• Если вы получили продукт , а не в течение гарантированного времени (45 дней, не включая 2–5-дневную обработку), вы можете запросить возврат или повторную отправку.
• Если вы получили не тот товар, вы можете запросить возврат или повторную отправку.
• Если вам не нужен полученный товар, вы можете запросить возмещение, но вы должны вернуть товар за свой счет, и товар должен быть неиспользованным.

Мы делаем , а не оформляем возврат, если:

• Ваш заказ не был доставлен по причинам, находящимся под вашим контролем (например, неверный адрес доставки)
• Ваш заказ не был доставлен из-за исключительных обстоятельств, не зависящих от https://thematistore. com (т. Е. Не прошел таможенную очистку, задержался в результате стихийного бедствия).
• Другие исключительные обстоятельства, не зависящие от https://thematistore.com

* Вы можете отправить запрос на возврат в течение 15 дней после истечения гарантированного срока доставки (45 дней). Вы можете сделать это, отправив сообщение на странице «Контакты»

.

Если вы одобрены для возврата, то ваш возврат будет обработан, и кредит будет автоматически зачислен на вашу кредитную карту или исходный способ оплаты в течение 14 дней.

Биржи

Если по какой-либо причине вы хотите обменять свой товар, возможно, на одежду другого размера.Сначала вы должны связаться с нами, и мы проведем вас через все шаги.

Пожалуйста, не отправляйте нам свою покупку обратно, если мы не уполномочим вас на это.

Как распылить краску для фонарного столба

14 октября 2014 г. Автор: Анита

Поделиться в социальных сетях

Наш дом в основном белый с голубовато-серым сайдингом и коричневой черепицей.

Но наш почтовый ящик и фонарный столб черные, и мне очень не нравится столкновение. Поэтому вместо того, чтобы покупать новый фонарный столб, я решил покрасить его распылением.Ниже вы найдете инструкции, как покрасить фонарный столб.

Пожалуйста, не обращайте внимания на нашу траву / сорняки на этих фотографиях. Мы пытаемся возродить наш газон с тех пор, как купили отчужденный дом (с полностью мертвой травой). Так как нам не повезло выращивать траву, только сорняки, мы решили полностью пересадить ее следующей весной, так что сейчас это действительно некрасиво.

Шаг 1. Убедитесь, что погода подходящая. Не следует распылять краску на фонарный столб, если влажность или жара слишком высоки.Также не стоит распылять краску на морозе. Следуйте инструкциям на баллончиках с грунтовкой и аэрозольной краской. Я загрунтовал и покрасил, когда на улице было около 70 градусов.

Обычно для аэрозольных красок указывается, что температура должна быть в пределах 50-80 градусов по Фаренгейту. Избегайте окрашивания при влажности выше 85%. Также лучше избегать рисования под прямыми солнечными лучами. Я рисовал в пасмурный день, и это было хорошо, потому что металл не был слишком горячим.

Шаг 2. Хорошо вымойте предмет, который вы собираетесь раскрашивать.Я обрызгал его из нашего шланга и протер губкой. Дайте ему высохнуть или полностью просушите.

Шаг 3: Заклейте все, что вы не хотите красить. Я заклеил окна фонарных столбов.

Шаг 4: Оберните вокруг основы газеты, чтобы не распылять краску на лужайку (если вам не все равно). Я не стал этого делать, потому что сейчас у меня нет лужайки, о которой я бы хотел.

Шаг 5: Удалите все расположенные поблизости предметы, на которые вы не хотите попасть из-за распыления (автомобиль, припаркованный на подъездной дорожке, велосипед и т. Д.).

Шаг 6: Заправьте фонарный столб. Я использовал профессиональную грунтовку Rust-Oleum для алюминия. Мне нравится использовать ручку / рукоятку для аэрозольной краски Rust-Oleum. Это действительно делает процесс намного быстрее и намного проще для ваших рук, пальцев и запястий.

Дайте грунтовке высохнуть в течение рекомендованного времени между слоями (около 15 минут в зависимости от марки). Добавьте второй слой грунтовки.

Шаг 7: После высыхания грунтовки (около 15 минут в зависимости от марки).Добавьте последний слой краской того типа, который вам нужен. Я использовал белую аэрозольную краску Rust-Oleum Textured для наружного применения, которая останавливает ржавчину. Очень важно распылять слегка и следовать указаниям на банках. В итоге я добавил 2-3 легких слоя аэрозольной краски поверх грунтовки.

Шаг 8: Дайте высохнуть и проверьте, нет ли действительно светлых участков, подкрасьте.

Шаг 9: Следуйте тем же инструкциям на верхней части фонарного столба, крепежных деталях и / или других частях фонарного столба.

Шаг 10: Удалите ленту и газету.

Готово!

Я покрасил свой фонарный столб более месяца назад, и, несмотря на жаркие дни, проливные дожди, недавние морозы и т. Д., Он выглядит так же, как в тот день, когда я его рисовал. Покраска идет очень хорошо. Лучшая часть? Теперь мой фонарный столб выглядит новым, соответствует моему дому и не торчит, как больной палец.

Наслаждайтесь своим проектом. Если у вас есть вопросы / комментарии, оставьте их ниже.

Принадлежности

Профессиональная грунтовка для алюминия Rust-Oleum объемом 1–15 унций

Рукоятка для аэрозольной краски Rust-Oleum

банка 1-12 унций Rust-Oleum Текстурированная белая краска-спрей для наружного применения

газета или картон

Малярная лента

Вот что было до и после преобразования нашего почтового ящика… плюс наш новый газон.

Чтобы получить другие «советы по богатой жизни», подпишитесь, как и я, на Facebook и подписывайтесь на меня в Pinterest и Instagram.

Как переделать цоколь лампы — Переделка лампы в комиссионном магазине — Decorhint

Мое любимое место, где я сейчас покупаю товары для дома, — это Goodwill.

Этот пост содержит партнерские ссылки для вашего удобства. Узнайте больше здесь.

Я стараюсь заглядывать туда каждый раз, когда что-то жертвую, а в наши дни это, кажется, много, так как мы только что переехали в наш новый дом.

В недавней поездке я забил эти две большие настольные лампы.

Совет: всегда держите в машине запасную лампочку на случай импровизированных визитов в комиссионный магазин или блошиный рынок! Так вы сможете убедиться, что лампы исправны, прежде чем покупать их.

Эти две лампы были глянцевые и выглядели немного устаревшими, но они работали.

Кроме того, у них не было абажуров, а в одной лампе отсутствовала арфа. Но все это меня не беспокоило.

Потому что мне понравился общий размер и форма.

И я знал, что могу превратить эти устаревшие лампы во что-нибудь крутое.

Plus — Я заплатил меньше 7 долларов за ОБЕИ лампы. Серьезно — я не мог отказаться от этого!

Мне нравится внешний вид матовой фактурной лампы. Лампа, которая выглядит несколько винтажно и ручной работы. Как старинная ваза с абажуром наверху.

Но за эти вещи вы заплатите состояния !

Вот несколько примеров.

Включите JavaScript для просмотра содержимого

Если бы я был Тейлор Свифт, я бы скупил их всех. Для меня они такие красивые.

Почти скульптурный. И они добавляют интереса к вашим пространствам.

Я хотел воссоздать этот «состаренный» вид с помощью этих двух ламп, и мне очень нравится то, как они получились.

Это было совсем несложно, и я расскажу вам, как именно я это сделал.

Если вам тоже нравятся эти фактурные состаренные лампы, читайте дальше.

Вещи, которые вам понадобятся

Как переделать цоколь лампы

Выполните следующие действия, чтобы заменить лампы.

Безопасность прежде всего! Краску следует распылять в хорошо проветриваемом помещении, желательно на улице или в открытом гараже.

Я всегда распыляю краску на картонную коробку, чтобы убрать беспорядок и сохранить зеленую траву.

Шаг 1. Подготовьте лампы к покраске

Снимите абажур и арфу, если они есть. Возьмите малярный скотч и заклейте те области, которые вы не хотите красить. Я заклеил изолентой розетку, выключатель, держатель для арфы и основание, а также вилку и шнур.

Слегка отшлифуйте цоколь лампы, чтобы аэрозольная краска прилипла к некоторым участкам.

Наконец, возьмите чистую сухую тряпку и вытрите ее, чтобы она была чистой и сухой.

Шаг 2. Сначала нанесите грунтовку распылением

Какого бы цвета ни был цоколь лампы, сначала распылите этот цвет. (Используйте грунтовку).

Я хотел, чтобы одна лампа была матовой белого цвета, а другая — коричнево-черной матовой текстуры.

Я покрасил одну краску краской Rustoleum и грунтовкой x2 Ultra Matte White, а другую — черным.

Вы можете подумать, что можете просто покрасить лампы с эффектом камня распылением, но поверьте мне — это не закроет то, что находится под ним, и будет выглядеть странно.

После высыхания грунтовки пора наносить текстурированную краску. Woot!

Шаг 3: Распыление краски «Эффект камня» поверх грунтовки

Вот где происходит волшебство!

Я использовал краску Stone Spray Paint in Bleached Stone для своей белой лампы.

Распылить легкие лаки по всей поверхности. Какое удовольствие видеть, как эти лампы преображаются прямо перед вами!

Я использовал краску Mineral Brown Stone на черной лампе.

Для обеих ламп я нанес пару слоев аэрозольной краски для камня на каждую.Я не особо заботился о совершенстве — в конце концов, он должен был выглядеть изношенным и старым.

Однако будьте осторожны, чтобы не распылить слишком много текстуры камня в одной области. Он должен выглядеть как-то ровно по кругу.

И не бойтесь при необходимости распылить еще грунтовочную краску. Некоторые из моих участков выглядели немного слабоватыми по цвету, поэтому я усилил их с помощью дополнительной грунтовки.

Дайте лампе просохнуть на ночь.

Шаг 4. Снимите малярную ленту и прикрепите абажуры

Если вы купили лампу с недостающими частями, как моя, вам может быть интересно, где, черт возьми, можно взять запасные части для лампы?

Мне нужна арфа и навершие.

К счастью, Home Depot и Lowe’s продают тонны запчастей для ламп довольно дешево, менее чем за 5 долларов. И они вроде бы всегда есть в наличии. Они также продают абажуры по приличным ценам, но вы также можете попробовать HomeGoods и Target.

Я так доволен тем, как они выглядят!

В общем, эти лампы обошлись мне меньше 20 долларов за все, включая плафоны.

Получить хорошую большую лампу за эту цену — безумие!

Это ваш небольшой толчок, чтобы проверить сберегательные магазины и блошиные рынки рядом с вами.

Вы можете завершить этот проект за выходные и получить почти новый, красивый светильник для своих комнат!

Ксо Карен

Реакция изотермической амплификации, опосредованной петлей (LAMP), в качестве жизнеспособной замены ПЦР для диагностических приложений: сравнительное исследование LAMP, стандартной ПЦР, вложенной ПЦР (nPCR) и ПЦР в реальном времени (qPCR) на основе ДНК Entamoeba histolytica, полученной из образца фекалий | BMC Biotechnology

Реагенты и оборудование

Козье вторичное антитело против мышиного IgG, моноклональное антитело IgG1 к стрептавидину и флуоресцеина изотиоцианату (FITC), используемое для разработки иммуноанализа бокового потока нуклеиновых кислот или обычно называемое индикаторной полоской бокового потока (LFD), было Pierce Thermo Продукция Fisher Scientific (Массачусетс, США). Используемый раствор коллоидного золота 40 нм был от Kestrel Bio Sciences (Таиланд), Вестерн-блокирующий реагент (WBR) был от Roche (Индианаполис, США), а бычий сывороточный альбумин (BSA) был приобретен у Amresco (Solon, США). Бетаин, минеральное масло, азид натрия (NaN ₃ ), поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP), Triton X-100, Tween-20, сахароза и другие распространенные химические вещества были от Sigma (Сент-Луис, США). . Все химические вещества и реагенты, использованные в этом исследовании, были приготовлены с использованием сверхчистой воды (> 18 МОм) из системы очистки воды Millipore Milli-Q (Billerica, США).Между тем, материалы, используемые для конструкции LFD, включая прокладки из целлюлозного волокна, прокладки из стекловолокна и карту нитроцеллюлозных мембран HF135, также были продуктами Millipore.

Все меченые и немеченые олигонуклеотиды были синтезированы Integrated DNA Technologies (Сингапур). Рекомбинантную ДНК-полимеразу Taq (Thermo Fisher, США) использовали в качестве фермента-полимеразы для стандартной ПЦР и nPCR-амплификации, и эти реакции проводили с использованием градиентного термоциклера Mastercycler nexus (Eppendorf, Германия). Между тем, qPCR выполняли с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия), а реакцию проводили с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad, Калифорния, США). ДНК-полимераза LAMP Bst была приобретена в New England Biolabs (Массачусетс, США), и амплификацию проводили с использованием охлаждающего нагревательного блока Cole-Parmer (Иллинойс, США). Обычные ампликоны ПЦР, nPCR и LAMP анализировали с помощью системы электрофореза в агарозном геле (Owl Separation Systems, США) и визуализировали с использованием УФ-осветителя Alpha Innotech ChemiImager 5500 и устройства захвата изображений (Калифорния, США).LFD выстилали вторичным антителом козы против IgG мыши и стрептавидином вручную и разрезали на полоски с использованием программируемого резака для полос Matrix 2360 от Kinematic Automation (Twain Harte, США). Кальцеин-марганцевый краситель, используемый для анализа post-LAMP, был приготовлен с использованием комбинации индикатора кальцеина (Merck, США) и хлорида марганца (II) (MnCl ₂ ) (Merck, США).

Entamoeba видов и других штаммов микроорганизмов

Все изоляты микроорганизмов, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1.Эти изоляты были взяты из Экспериментального департамента медицины, Факультет медицины, Национальный автономный университет Мексики, Мексика; Лондонская школа гигиены и тропической медицины, Лондон, Великобритания; Департамент медицинской микробиологии и паразитологии Школы медицинских наук Университета Саинс Малайзия, Малайзия; и Институт медицинских исследований, Малайзия. E. histolytica HM-1 : IMSS использовали в качестве положительного контроля при лиофилизации E. dispar SAW760 и E.moshkovskii Laredo использовались в качестве отрицательного контроля в этом исследовании. ДНК E. histolytica была выделена из аксенически выращенного E. histolytica HM-1 : IMSS, тогда как ДНК E. dispar была выделена из лиофилизированного E. dispar SAW760 с использованием набора для экстракции стула ДНК Qiagen QIAamp (Германия) . Оба микроорганизма были получены из Экспериментального департамента медицины, Факультет медицины, Национальный автономный университет Мексики, Мексика. Между тем, ДНК E.moshkovskii Laredo предоставлен Лондонской школой гигиены и тропической медицины, Лондон, Великобритания. ДНК других микроорганизмов выделяли из чистой культуры бактерий с использованием набора NucleoSpin Tissue DNA Extraction (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Германия). Эти ДНК использовали в качестве отрицательного контроля для проверки специфичности общепринятых ПЦР, яПЦР, количественной ПЦР и специфичности праймеров LAMP.

Таблица 1 Эталонные организмы, использованные в данном исследовании, и результаты оценки аналитической специфичности

Дизайн праймеров

Ген SREHP был выбран в качестве целевого гена для обнаружения E.histolytica в настоящем исследовании из-за его высокой специфичности как в in silico (поиск BLAST), так и в эмпирической оценке (ПЦР и LAMP-амплификация) по сравнению с другими генами E. histolytica . Все праймеры, использованные в этом исследовании, были разработаны на основе консервативной области указанного гена SREHP (номер доступа в GenBank M80910.1, M34438.1, XM_643162.2, AB253474.1, AK420158.1, AK420282.1, AK420358.1, AK420741.1). Набор праймеров, используемый для нанесения LAMP, был взят из предыдущего исследования Foo et al.[21], а расположение праймеров показано на фиг. 1. Праймеры Eh-F3-SER и Eh-B3-SER использовали в качестве внешних праймеров для первого раунда амплификации нПЦР, которая могла генерировать ампликон размером 223 п.н. Между тем, пара праймеров, используемая для обычной ПЦР, второго раунда nPCR и qPCR-амплификации, была адаптирована из области F2 Eh-FIP-SER в качестве прямого праймера и области B2 Eh-BIP-SER в качестве обратного праймера; который мог генерировать ампликон размером 175 п.н. Праймеры, используемые для амплификации LAMP, которые связаны с LFD, в частности Eh-BIP-SER и Eh-LB-SER, были подвергнуты модификации с использованием мечения гаптеном на 5′-конце олигонуклеотидной последовательности. Флуоресцеин был помечен на 5′-конце Eh-BIP-SER, тогда как Eh-LB-SER был помечен биотином. Все последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 2. Специфичность этих праймеров была подтверждена эмпирически с использованием ДНК, выделенной из E. histolytica , E. dispar , E. moshkovskii Laredo и 75 других патогенов, таких как показаны в Таблице 1 до того, как было проведено сравнение аналитической чувствительности среди анализов.

Рис.1

Праймерные области последовательности гена SREHP (номер доступа в GenBank.M80910.1). Праймер Eh-FIP-SER сформирован с F1C ​​и Eh-F2, тогда как праймер Eh-BIP-SER сформирован с B1C и Eh-B2

Таблица 2 Олигонуклеотидные последовательности, используемые в этом исследовании

Состав LAMP, стандартная ПЦР, nPCR и Анализ qPCR

LAMP

Отношение внешнего праймера к внутреннему праймеру было оптимизировано, и концентрация праймеров была оптимальной с 2 ​​мкМ каждого прямого внутреннего праймера (Eh-FIP-SER) и обратного внутреннего праймера (Eh-BIP-SER). 0,167 мкМ каждого прямого внешнего праймера (Eh-F3-SER) и обратного внешнего праймера (Eh-B3-SER), и 0.333 мкМ праймера обратной петли (Eh-LB-SER). Концентрации компонентов LAMP, таких как смесь dNTP, бетаин, MgSO4 и ДНК-полимераза Bst , были оптимизированы и определены эмпирически. Реакцию проводили с конечным объемом 30 мкл реакционной смеси, содержащей 1 × изотермический буфер для амплификации [20 мМ трис-HCl (pH 8,8), 50 мМ KCl, 10 мМ (Nh5) ₂ SO ₄ , 2 мМ MgSO ₄ , 0,1% Твина 20] (New England Biolabs, Массачусетс, США), 0.6 мМ смеси дНТФ (Thermo Fisher Scientific, США), 0,8 М бетаина (Sigma, Миссури, США), дополнительно 6 мМ MgSO ₄ (New England Biolabs, Массачусетс, США), 16 единиц Bst 2,0 ДНК-полимераза WarmStart (New England Biolabs, Массачусетс, США) и 2 мкл ДНК-матрицы. Реакцию проводили при 63 ° C в течение 60 минут с последующим прекращением при 80 ° C в течение 5 минут. Продукт LAMP подвергали электрофорезу в агарозном геле, LFD и кальцеин-марганцевому красителю для анализа после LAMP.

Обычная ПЦР

Праймеры Eh-F2 и Eh-B2 с концентрацией 1 мкМ каждый использовали для стандартной ПЦР-амплификации. Амплификацию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 1 × буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCl ₂ (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США), 0,16 мМ смеси dNTPs (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США), 1 ед. ДНК-полимеразы Taq (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США) и 2 мкл ДНК-матрицы. Реакцию ПЦР проводили с начальной денатурацией при 95 ° C в течение 5 минут, затем следовали 35 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 56 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд; и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин.Продукт подвергали гель-электрофорезу в 2% агарозном геле, окрашенном красителем GelStain (TransGen Biotech Co, Пекин), электрофоретически проводили при 100 В в течение 60 мин с последующей визуализацией с помощью анализатора ChemiImage 5000.

nPCR

Первый раунд ПЦР проводили с парой праймеров Eh-F3-SER и Eh-B3-SER с концентрацией 1 мкМ каждый. Амплификацию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 1 × буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCl ₂ (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США), 0.Смесь 16 мМ dNTP (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США), 1 ед. ДНК-полимеразы Taq (Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США) и 2 мкл ДНК-матрицы. Реакцию ПЦР проводили с начальной денатурацией при 95 ° C в течение 5 минут, затем следовали 30 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд; и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин. Между тем, второй раунд ПЦР проводили с парой праймеров Eh-F2 и Eh-B2 с концентрацией 1 мкМ каждый. Используемый состав реагентов был аналогичен первому раунду ПЦР.Реакцию проводили с начальной денатурацией при 95 ° C в течение 5 минут, затем следовали 35 циклов 95 ° C в течение 30 секунд, 56 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд; и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин. Продукт подвергали гель-электрофорезу в 2% агарозном геле, окрашенном красителем GelStain, электрофоретически проводили при 100 В в течение 60 мин, затем визуализировали с помощью анализатора ChemiImage 5000.

qPCR

Подобно традиционной ПЦР и реакции второго раунда nPCR, реакцию qPCR проводили с парой праймеров Eh-F2 и Eh-B2 с концентрацией 1 мкМ каждый.Амплификацию проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 1 × QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix и 2 мкл матрицы ДНК. Реакцию проводили в условиях термоциклирования начальной денатурации при 95 ° C в течение 5 минут, затем следовали 40 циклов при 95 ° C в течение 20 с и 56 ° C в течение 30 секунд. Анализ кривой плавления проводили при медленном увеличении от 65 ° C до 95 ° C со скоростью 0,5 ° C за 5 с. Базовый порог для постамплификационного анализа был установлен на уровне 50 относительных единиц флуоресценции (RFU), и любое значение цикла количественного анализа (Cq) ниже или равное 38 считается положительным.

Подготовка пост-LAMP анализа

Конструкция LFD

Золотая наночастица (GNP) использовалась в качестве генератора сигналов для LFD в этом исследовании. Биоконъюгацию ЗНЧ с моноклональным антителом FITC IgG1 и получение LFD проводили, как описано Foo et al. [21] с некоторыми изменениями. Полоска LFD размером 5 мм × 77 мм, состоящая из подушечки для нанесения буфера, подушки золотого конъюгата, нитроцеллюлозной мембраны и абсорбирующей подушки, как показано на рис. 2. LFD была прикреплена с 1 мкг козьего антимышиного вторичного антитела IgG в качестве хроматографии. контрольная линия (CCL) и 2 мкг стрептавидина в качестве тестовой линии (TL) с последующим блокированием непокрытой поверхности нитроцеллюлозы блокирующим буфером [смесь 0.2% WBR, 0,05% тритона X-100 и 2 мМ фосфатного буфера (PB)]. Подушку золотого конъюгата готовили из функционализированной суспензии конъюгированных ЗНЧ [5 OD ₅₂₂ золотого конъюгата, суспендированного в 2 мМ PB, содержащем 20% (мас. / Об.) Сахарозы, 0,01% (об. / Об.) ПВС и 0,01% (об. / Об.) Твин-20] в формате сухого реагента, как описано Foo et al. [21].

Рис. 2

Принципиальная схема индикаторной полоски с боковым потоком

Приготовление кальцеин-марганцевого красителя

Кальцеин-марганцевый краситель был сделан из 500 мкМ кальцеина, растворенного в диметилсульфоксиде (Merck, США) и 10 мМ MnCl ₂ , растворенный в воде, свободной от нуклеаз. Для каждой реакции требуется всего 1 мкл кальцеин-марганцевого красителя.

Принцип LFD

LFD был разработан для специфического распознавания его двухцепочечного двухцепочечного ДНК-ампликона посредством связывания биотина, меченного на 5′-конце ампликонов, со стрептавидином на нитроцеллюлозной мембране LFD. Тестовая линия требовала амплифицированных двухцепочечных двухцепочечных ампликонов в качестве соединительного мостика для генерации сигнала, который представляет присутствие / отсутствие целевой ДНК. Двухцепочечные двухцепочечные ампликоны (продукт LAMP) для TL были помечены FAM на 5′-конце, синтезированном внутренними праймерами, тогда как другой 5′-конец, который синтезируется с помощью петлевого праймера, был помечен биотином (рис.3. Стрептавидин на TL образует белок-лигандное связывание с биотином на ампликонах с двойной меткой. Между тем, CCL, связанный с козьим вторичным антителом против IgG мыши, образовывал белок-лигандное аффинное связывание с моноклональным антителом FITC IgG1 мыши, которое конъюгировалось на наночастицах золота.

Рис. 3

Схематическая иллюстрация образования двойного меченого ампликона (продукт LAMP), работающего в качестве аналита для обнаружения LFD

На рисунке 4 схематично проиллюстрирован принцип продукта LAMP, захваченного стрептавидином на подушечке для обнаружения LFD.Стрептавидин, прикрепленный к области обнаружения, иммобилизовал ампликоны за счет связывания белок-лиганд, образованного биотином, меченным на ампликонах. Двухцепочечные ампликоны образованы последовательностями внутренних праймеров LAMP и последовательностями праймеров петли. Следовательно, другой 5′-конец ампликона был представлен FAM, который связывался с козьими антимышиными антителами, конъюгированными с наночастицами золота. Присутствие розовато-красной линии в области обнаружения свидетельствует о завершении сэндвича гибридизации между конъюгированными GNP, продуктом LAMP и стрептавидином, что интерпретируется как положительный результат.

Рис. 4

Схематическое изображение принципа работы LFD. На иллюстрации показано, что продукт LAMP иммобилизован на мембране стрептавидином с последующей генерацией сигнала конъюгированными ЗНЧ, которые связываются с флуоресцеином

Анализ Post-LAMP

Анализ Post-LAMP проводили тремя различными методами, а именно электрофорезом в агарозном геле, LFD и кальцеин-марганцевый краситель. Продукт LAMP подвергали гель-электрофорезу в 2,5% агарозном геле, окрашенном красителем GelStain, электрофоретически проводили при 100 В в течение 80 мин с последующей визуализацией с использованием анализатора ChemiImage 5000.Наличие лестничного рисунка полос на агарозном геле указывает на положительную амплификацию.

Обнаружение продукта LAMP с помощью LFD было аналогично предыдущему исследованию [21]. Амплифицированный продукт в количестве 4 мкл смешивали с 16 мкл рабочего буфера [1 × PBS и 1% (об. / Об.) Твин-20], и смесь по каплям наносили на область обнаружения. Затем LFD помещали вертикально с последующим погружением подушечки для нанесения буфера в 250 мкл рабочего буфера. Результат можно было визуализировать невооруженным глазом в течение 10-15 мин на нитроцеллюлозной мембране LFD.Образование красной пунктирной линии на TL указывает на положительный результат, в то время как отсутствие TL указывает на отрицательный результат. CCL на LFD служил процедурным и операционным контролем для каждого анализа продукта LAMP. Формирование линий на CCL указывало на эффективность генератора сигналов, функционализированных ЗНЧ, в то время как отсутствие CCL указывало на ложноотрицательный результат.

Анализ продукта LAMP с использованием кальцеин-марганцевого красителя выполняли путем смешивания 1 мкл кальцеин-марганцевого красителя с 30 мкл смеси реагентов LAMP перед амплификацией.С помощью УФ-света трубка, которая стала флуоресцентно-зеленой, считалась положительной, в то время как отрицательное усиление оставалось тускло-зеленым.

Аналитическая специфичность тестов

Аналитическая специфичность праймеров, используемых для LAMP, стандартной ПЦР, nPCR и qPCR, определялась с использованием ДНК, выделенной из E. histolytica , E. dispar , E. moshkovskii Laredo и 75 других патогенов, перечисленных в таблице 1. Чтобы убедиться, что его специфичность была всесторонне изучена, это исследование было проведено отдельно с использованием LAMP, стандартной ПЦР, яПЦР и количественной ПЦР.

Оценка эффективности анализов

Все 4 анализа амплификации были оптимизированы в этом исследовании. Эффективность анализов оценивалась на основе их аналитической чувствительности в отношении LoD с использованием 10-кратно разведенных трофозоитов E. histolytica , разведенных в 10 раз. Разбавленные трофозоиты в диапазоне от 10 ⁶ до 10 90 483 — 4 90 484 трофозоитов добавляли в 200 мг образцов стула и оставляли на 1 час при температуре окружающей среды перед выделением ДНК. Экстрагированные ДНК из образцов стула с добавками в диапазоне от 10 ⁶ до 10 ^{— 3} трофозоитов были использованы для ПЦР, в то время как LoD для амплификации LAMP был определен с использованием диапазона трофозоитов до 10 ^{— 4} . Все оценочные тесты были выполнены в трех экземплярах.

Мини-обзор: недавний прогресс в обнаружении COVID-19 с помощью RT-LAMP

https://doi.org/10.1016/j.snr.2020.100017Получить права и контент

Основные моменты

•

Срочно выделено чувствительное обнаружение SARS-CoV-2.

•

Представлен принцип работы LAMP-анализа для обнаружения нуклеиновых кислот.

•

Обобщены методы изотермической амплификации с RT-LAMP для диагностики COVID-19.

•

Были представлены и обсуждены будущие тенденции выявления COVID-19.

Реферат

Пандемия коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19) заразила миллионы людей по всему миру. Вспышка, вызванная новым коронавирусом (SARS-CoV-2), представляет большой риск для здоровья населения. Поэтому быстрая и точная диагностика вируса играет решающую роль в лечении болезни и спасении жизней. В настоящее время стандартным методом обнаружения коронавируса является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Однако лабораторный тест ОТ-ПЦР для SARS-COV-2 требует сложного оборудования и тщательного обучения операторов, что приводит к ограничению возможностей тестирования и задержке результатов. Следовательно, изотермическая ПЦР, такая как петлевой изотермической амплификации (LAMP), стала прекрасной альтернативой методу ОТ-ПЦР. LAMP обладает некоторыми фундаментальными преимуществами, такими как амплификация при постоянной температуре, исключение термоциклера, более быстрый результат теста и потенциально большая диагностическая способность при сохранении аналогичной чувствительности и специфичности, что делает его более подходящим, чем RT-PCR для мониторинга. пандемия.Начиная с краткого введения в принцип работы метода LAMP, этот обзор суммирует недавний прогресс в обнаружении вирусной РНК SARS-CoV-2 с помощью LAMP. Наконец, обсуждаются будущие направления исследований. Этот критический обзор побудит сообщество биосенсоров к дальнейшему развитию настоящего исследования, которое может проложить путь к быстрому и крупномасштабному скринингу SARS-CoV-2.

Ключевые слова

RT-LAMP

COVID-19

Молекулярная диагностика

Изотермическая амплификация

Rapid

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2020 Автор (ы).Опубликовано Elsevier BV

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

LAMP-Seq обеспечивает чувствительную мультиплексную диагностику COVID-19 с использованием молекулярного штрих-кодирования

Масштабируемое обнаружение SARS-CoV-2 на основе глубокого секвенирования

RT-LAMP использует шесть мишеней специфические праймеры и полимераза, замещающая цепи (рис. 1a), и было показано, что она обнаруживает патогены в неочищенных образцах с высокой чувствительностью ¹⁴ . Чтобы установить реакцию RT-LAMP со штрих-кодом, подходящую для обнаружения на основе крупномасштабного секвенирования следующего поколения (NGS), мы разработали набор штрих-кодов праймеров на основе проверенного ампликона RT-LAMP ¹⁵ , который соответствует 94. 1% из 42 904 геномов SARS-CoV-2, имеющихся в базе данных Национального центра биотехнологической информации (по состоянию на 11 марта 2021 года; дополнительные данные 1). Штрих-коды (длиной 10 нт, содержание GC 30–70% и отсутствие гомополимерных повторов из четырех или более нуклеотидов) были вставлены в прямой внутренний праймер (FIP) (обозначенный как «штрих-коды LAMP» (LAMP-BC)) (рис. . 1b). Чтобы снизить риск неправильной атрибуции образца из-за ошибок секвенирования, мы обеспечили расстояние редактирования Левенштейна ¹⁶ между любой парой штрих-кодов из трех или более.Дальнейшая масштабируемость может быть достигнута путем введения второго уровня штрих-кодов на этапе ПЦР для объединенных образцов с использованием двух стандартных штрих-кодов ПЦР (PCR-BC): i5 и i7 (дополнительные данные 1). Окончательная структура библиотеки секвенирования показана на рис. 1b.

Рис. 1: LAMP-Seq: масштабируемый подход на основе глубокого секвенирования для обнаружения SARS-CoV-2.

a , Схема ожидаемых ферментативных реакций и продуктов реакции. b , Аннотированная последовательность ампликона для Illumina NGS продуктов SARS-CoV-2 RT-LAMP. c , Оценка чувствительности LAMP-Seq с использованием 24 реакций на условие, шаблон с указанным количеством молекул РНК на реакцию. Закрашенные квадраты обозначают штрих-коды с числами считывания> 10% от медианы, рассчитанной на 24 положительных образцах. Модификации LNA увеличивают температуру плавления с 53,7 ° C до 60,1 ° C для F3 и с 50,0 ° C до 57,3 ° C для B3. d , Оценка LoD-95 ​​на основе пробит-анализа доли положительных результатов среди 24 повторов. и , реакции LAMP-Seq с шаблонами для 100, 10 000 или 100 000 молекул РНК.Реакции амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали на секвенаторе Illumina MiSeq. Абсолютное количество считываний на образец показано для десяти экспериментальных повторов для каждого условия. f , Количественная оценка замены штрих-кода в LAMP-Seq и зависимость от предварительного разбавления объединенных реакций RT-LAMP перед ПЦР (левая панель, 1000 раз; правая панель, 1000000 раз). LAMP-Seq выполняли, как описано в разделе «Методы», за исключением того, что синтетическая РНК использовалась в качестве матрицы вместо образца мазка, без Bst 3.0 или трис-буфер и не использовали праймеры, модифицированные LNA. Цифры на графике указывают числа считывания для нетрадиционных реакций отрицательного контроля. г , Эмпирическая оценка эффективности 480 случайно выбранных праймеров для штрих-кода LAMP-Seq. FIP со штрих-кодом смешивали в эквимолярной концентрации и использовали в качестве пула в четырех повторных реакциях LAMP-Seq, шаблонизированных с помощью РНК. Необработанные данные секвенирования анализировали с помощью LAMP-Seq Inspector v1.0 (http://manuscript.lamp-seq.org/Inspector.htm). Счетчики считывания отображаются для штрих-кодов в порядке убывания.Шесть наименее эффективных последовательностей штрих-кода выделены красным, а соответствующие последовательности представлены на вставке. оцРНК, одноцепочечная РНК.

Сначала мы определили молекулярную чувствительность реакций RT-LAMP со штрих-кодом с использованием транскрибированной in vitro (IVT) матричной РНК и коммерческих реагентов RT-LAMP (методы). Мы включили праймеры F3 и B3 с модификациями заблокированной нуклеиновой кислоты (LNA) или без них, которые могут увеличивать аффинность связывания ¹⁷ (рис. 1c; положения модификаций LNA описаны в разделе «Методы»).Мы получили предел обнаружения с достоверностью 95% (LoD-95) примерно 18 молекул РНК на анализ, используя пробит-анализ (эквивалент 2,2 копий на мкл (рис. 1d)). Это похоже на чувствительность стандартного анализа RT – qPCR гена E , используемого для клинической диагностики в Университетской клинике Бонна (LoD-95: 18,4 молекул, с использованием РНК IVT). Создание шаблонов реакций LAMP с индивидуальным штрих-кодом, которые различаются в 100 или 10 000 раз по количеству РНК-матрицы, их комбинирование для амплификации ПЦР и секвенирования продуктов привело к насыщенным числам считывания (рис.1д). Это указывает на то, что насыщение RT-LAMP эффективно сжимает динамический диапазон от входных вирусных нагрузок до считываний секвенирования, что позволяет анализировать большое количество образцов, охватывающих широкий диапазон вирусных нагрузок, за один цикл секвенирования.

Затем мы оптимизировали объединение штрих-кодированных реакций RT – LAMP для (1) минимизации уровней подмены штрих-кода и (2) обеспечения достаточного количества индивидуально проверенных штрих-кодов. Мы наблюдали умеренные уровни подмены штрих-кода, когда мы объединили шесть реакций RT-LAMP со штрих-кодом, три из которых были шаблонированы с IVT РНК перед ПЦР и секвенированием (рис.1е, левая панель). Мы предположили, что введение штрих-кодовых праймеров в реакцию ПЦР привело к амплификации и повторному штрих-кодированию ампликонов. В подтверждение этого мы устранили обнаруживаемую подмену штрих-кода, разбавив объединенные реакции RT-LAMP в 10 ⁶ раз в конечной реакции ПЦР (рис. 1f, правая панель). Наконец, мы объединили 480 FIP со штрих-кодом и выполнили LAMP-Seq в четырех повторностях. Распределение штрих-кода в продуктах показало, что ~ 5% последовательностей штрих-кода плохо работают или даже не взаимодействуют с LAMP-Seq (рис.1г). Наименее эффективные праймеры штрих-кода демонстрируют заметное обогащение мотива GTCC или его усечений, особенно по направлению к 3′-концу штрих-кода (рис. 1g, вставка). Это обратное дополнение 3′-конца FIP, предполагая, что он изолирует FIPs на их 3′-конце, образуя внутримолекулярные структуры. Таким образом, этой гомологии следует избегать при разработке штрих-кода, и мы предоставляем 192 экспериментально подтвержденных штрих-кода FIP в дополнительных данных 1 (праймеры штрих-кода N-FIP TIER-1). Чтобы включить масштабирование LAMP-Seq, мы дополнительно протестировали библиотеку штрих-кодов N ₁₀ и идентифицировали около 10 000 функциональных штрих-кодов.Из них мы in silico разработали набор из 3840 штрих-кодов на основе минимального расстояния редактирования 3, которые не зависят от набора праймеров TIER 1 (дополнительные данные 1 (праймеры штрих-кода N-FIP TIER-2)).

Для безопасного использования LAMP-Seq в образцах пациентов мы подтвердили, что вирус SARS-CoV-2 был инактивирован в буфере для лизиса QuickExtract как через 30 минут инкубации при 65 ° C, так и через 10 минут при 95 ° C. Обе инкубации привели к более чем 40000-кратному снижению вирусной инфекционности, тогда как 30-минутная инкубация при 22 ° C привела к остаточной инфекционности SARS-CoV-2. Эффективность инактивации лизисного буфера была дополнительно продемонстрирована путем наблюдения> 10 ⁷ -кратного снижения вирусной инфекционности высокой дозы вируса везикулярного стоматита (VSV) после инкубации при 65 ° C в течение 20 минут (дополнительная таблица 1).

Клиническая валидация LAMP-Seq с использованием коммерческих реагентов

Затем мы протестировали 57 образцов человека с высокой заболеваемостью, используя LAMP-Seq, наряду с клинически одобренным диагностическим конвейером RT – qPCR. После получения информированного согласия у каждого человека были взяты два образца мазка из ротоглотки с использованием двух отдельных ватных тампонов.Один случайно выбранный мазок был проанализирован с использованием утвержденного конвейера клинической диагностики, включающего регидратацию, роботизированную очистку РНК и RT – qPCR с использованием специфичных для генов праймеров E (которые, как сообщается, более чувствительны, чем праймеры для других целей ¹⁸ ; рис. 2а, верхняя панель). Другой тампон немедленно вставляли в пробирку, содержащую лизисный буфер QuickExtract ¹⁹ (рис. 2а, нижняя панель), и 8,3 мкл лизата обрабатывали LAMP-Seq в четырех повторностях с использованием индивидуальных LAMP-BC и PCR-BC с мультиплексированный контроль E1 или β-актина в одной из повторностей (методы).Нефильтрованные данные LAMP-Seq отображали ожидаемую структуру считывания, включающую последовательности праймеров, последовательности вирусного генома и совпадающие штрих-коды (рис. 2b). После секвенирования было определено среднее число считываний для четырех положительных повторов, и реплики образцов считались положительными, если они показывали не менее 10% от этого числа считываний. Двадцать два из 25 человек, которые были идентифицированы как положительные по РНК SARS-CoV-2 с помощью RT-qPCR, также были идентифицированы как положительные с помощью LAMP-Seq (с двумя или более положительными повторами).Три необнаруженных образца показали очень низкие вирусные титры в клинической стадии (порог цикла (Ct): 36,96–38,52). Остальные 32 человека были идентифицированы как отрицательные по вирусной РНК (с превышением порогового значения для β-актина; рис. 2c). В совокупности наши данные с использованием коммерческих реагентов LAMP предполагают, что LAMP-Seq является высокочувствительным и специфическим подходом к тестированию SARS-CoV-2.

Рис. 2: Клиническая проверка LAMP-Seq.

a , Схема протокола, используемого для проверки LAMP-Seq (нижний рабочий процесс) по сравнению с установленным клиническим конвейером RT – qPCR (верхний рабочий процесс). b , данные секвенирования, полученные из образца мазка, положительного по SARS-CoV-2, с использованием LAMP-Seq. Базовые частоты обозначаются размером каждой буквы без применения фильтрации чтения. c , верхняя панель, положительные реплики LAMP-Seq (порог 10% от среднего числа считываний четырех реакций LAMP-Seq с наименьшими соответствующими значениями Ct) обозначены закрашенными квадратами. Реплики 1 и 2 обнаруживают только ген N ; репликация 3 представляет собой множественное обнаружение генов N и E ; репликация 4 представляет собой множественное обнаружение гена N и ACTB (β-актин; эндогенный контроль). Нижняя панель, кумулятивные числа считывания, полученные для каждого образца, упорядоченные по оценкам вирусных геномов на мазок, как определено методом RT – qPCR ( E , ген) на парном тампоне, с учетом различных объемов регидратации. Также показаны необработанные значения Ct RT – qPCR. Следует отметить, что набор праймеров для гена E не содержит модификаций LNA и обеспечивает более низкую чувствительность, что может быть полезно для кодирования количественной информации в логарифмическом масштабе. н.о., не определено.

Разработка протокола LAMP-Seq с открытым исходным кодом

Чтобы еще больше увеличить потенциал для крупномасштабного применения LAMP-Seq, мы создали версию с открытым исходным кодом, которая позволяет значительно снизить затраты и обеспечить независимость от цепочек поставок.Мы заменили все дорогостоящие элементы (буфер для лизиса и мастер-смесь ферментов LAMP) на буферы и ферменты собственного производства (методы) и снизили концентрацию dNTP и праймеров. Примечательно, что мы обнаружили, что одного большого фрагмента Bst-полимеразы из штамма Geobacillus , отобранного в Айдахо ²⁰ (Bst-LF-Idaho), достаточно для поддержания высокой чувствительности LAMP-Seq без обратной транскриптазы, но в присутствии модификаций LNA в праймерах F3 / B3 (дополнительный рис. 1). Применение этого протокола с открытым исходным кодом к разному количеству химически инактивированных частиц SARS-CoV-2 (методы) выявило незначительное увеличение LoD-95, составляющее 39 молекул на реакцию или около 4.7 молекул на мкл (рис. 3а). Мы также подтвердили высокую специфичность LAMP-Seq, поскольку не обнаружили ни одной из 15 других вирусных последовательностей (рис. 3b). Поскольку перекрестное загрязнение соседних лунок является серьезной проблемой в протоколах LAMP, мы провели эксперимент с шахматной доской со 192 положительными и 192 отрицательными образцами в дубликатах (рис. 3c). Используя набор грунтовок LAMP-BC Primer Set TIER 1, мы наблюдали устойчивый черно-белый узор, как и ожидалось. Спорадические подпороговые считывания (менее 10% медианы положительных считываний) имели место в семи из 192 позиций, и мы также наблюдали три ложноотрицательных результата.Этот последний эффект, однако, не зависел от штрих-кода, поскольку вторая лунка для этих образцов (включая идентичные LAMP-BC, но разные PCR-BC) была положительной в каждом случае. С помощью этого эксперимента с шахматной доской мы показали, что (1) перекрестное загрязнение соседних лунок должно быть минимальным, и (2) LAMP-Seq вызывает спорадические выпадения. Обе потенциальные проблемы можно решить, потребовав, чтобы две из четырех реплик были положительными. Стоимость проведения четырех повторов для каждого образца (100 мкл RT – LAMP) с использованием компонентов с открытым исходным кодом, без учета амортизации оборудования, рабочей силы и лицензий, составляет 2 доллара США.73 (по сравнению с 12,69 долларов США или коммерческим протоколом) (дополнительный рисунок 2).

Рис. 3. Проверка протокола LAMP-Seq с открытым исходным кодом.

a , Оценка LoD-95 ​​на основе пробит-анализа фракции положительных реплик с использованием титрования химически инактивированных вирусных частиц SARS-CoV-2, предоставленных XPRIZE Foundation. b , Определение специфичности с использованием IVT РНК панели геномов вирусов человека. c , 2 × 384 реакции LAMP-Seq, поочередно инокулированные IVT РНК (500 000 молекул на реакцию) в шахматном порядке для оценки специфичности штрих-кодирования и перекрестного загрязнения.Желтые кружки указывают на ложноотрицательные повторы. d , Краткое изложение клинического валидационного исследования с использованием LAMP-Seq с открытым исходным кодом на 676 образцах мазков, проведенного на роботах для работы с жидкостью и проанализированных параллельно с помощью клинической RT – qPCR после экстракции РНК из того же лизата. Образцы, помеченные как Ct> 36, включают поздние вызовы. e , Схематическое изображение предлагаемой масштабируемой процедуры тестирования, включающей саморегистрацию, полуцентрализованную RT-LAMP со штрих-кодом, объединение, упорядочение и электронную отчетность о результатах. Цветные полосы указывают на участок тестирования (красный), области перед LAMP (желтый) и после LAMP (зеленый). f , Фотографии, показывающие процесс сканирования отдельных QR-кодов, созданных во время саморегистрации, и 96-луночных планшетов для лизиса для немедленного элюирования вирусных частиц из ротоглоточных мазков без перекрестного загрязнения лунок (планшет предварительно запечатан; тампоны вставляются в лунки с помощью одноразовой воронки; затем лунку закрывают силиконовой пробкой). g , Сводная статистика 4-недельного пилотного исследования LAMP-Seq с открытым исходным кодом для обнаружения SARS-CoV-2.Всего было протестировано 5 139 бессимптомных добровольцев, из которых пять оказались положительными по крайней мере в двух повторностях и впоследствии подтверждены клинической RT – qPCR с тем же лизатом (значения Ct показаны ниже). Среднее время, проведенное на человека в нашем центре тестирования, составило 2 минуты.

Мы проверили LAMP-Seq с открытым исходным кодом на 676 образцах мазков, оставшихся после клинических испытаний, с четырьмя повторами на образец и с использованием автоматизированной обработки жидкости. Один положительный (РНК IVT) и один отрицательный контроль были включены в каждый 96-луночный планшет.LAMP-Seq показал чувствительность 100% (с двумя или более положительными повторами) среди положительных образцов с соответствующими значениями Ct <33 (рис. 3d, справа) в соответствии с нашими оценками LoD. Среди 578 образцов, которые были отрицательными с помощью RT – qPCR, три были определены как положительные с помощью LAMP-Seq, один из которых впоследствии был подтвержден как истинно положительный с использованием более чувствительного протокола RT – qPCR (методы). Из 16 образцов со значениями Ct между 33 и 36 15 образцов были идентифицированы как положительные по LAMP-Seq, тогда как 24 слабоположительных образца (Ct выше 36) были обнаружены стохастически (рис.3г, посередине).

Наконец, мы внедрили LAMP-Seq в непрерывный рабочий процесс (рис. 3e), который был протестирован в пилотном исследовании среди медицинского и немедицинского персонала университетской клиники Бонна (примечания по применению и рис. 3f). Вкратце, 96-луночные планшеты для лизиса заполняли лизисным буфером с открытым исходным кодом и контролями, герметизировали при нагревании проницаемой фольгой и транспортировали в место тестирования. После самостоятельной регистрации участники представились в центре. При поддержке визуального и звукового программного обеспечения обученный персонал проткнул одну позицию на пластине одноразовой воронкой, взял мазок из ротоглотки и затем ввел его через воронку в лунку.После погружения на 10 с тампон удаляли вместе с воронкой, а затем лунку закрывали силиконовой пробкой. После транспортировки в лабораторию pre-LAMP лизаты стерилизовали в термоблоке при 95 ° C, и 8,3 мкл лизированного образца штамповали в предварительно изготовленный 384-луночный планшет RT-LAMP со штрих-кодом. Это единственный обязательный этап переноса жидкости на образец. В лаборатории post-LAMP планшеты нагревали на водяной бане до 65 ° C и затем объединяли с помощью многоканального пипетирования или центрифугирования (методы). После мелкомасштабной ПЦР на отдельных пулах библиотеку загрузили на устройство MiSeq. В целом, LAMP-Seq был выполнен в течение 12 часов (2 часа мазок в лабораторию; 4 часа инактивации и подготовки библиотеки на основе LAMP; 5 часов секвенирования; и 0,5 часа анализа). Для образцов с по крайней мере двумя из четырех положительных повторов образец помещали на исходный 96-луночный планшет для лизиса и вводили в клиническое испытание qPCR. Положительные результаты теста были сообщены участнику и органам здравоохранения. Каждому испытуемому в цифровом виде сообщали об отрицательных результатах на основании индивидуального QR-кода (примечание по применению).В течение 4 недель мы протестировали 5 139 образцов и идентифицировали пять положительных образцов, все из которых были подтверждены с помощью количественной ПЦР из оставшегося лизата (значения Ct: 29–37; рис. 3g).

Переделка солярия для сушки УФ-грунтовки | 01 сентября 2015 г.

ВДОХНОВЕНИЕ: Грег Коккаро несколько лет использовал УФ-грунтовки в своем магазине North State Custom в Уайт-Плейнс, штат Нью-Йорк, и говорит, что всегда искал способы сократить время высыхания. Хотя у него были УФ-лампы меньшего размера — фактически две из них — они могли сушить только пятно размером не более 12х12 дюймов.

«Когда вы выполняете их на нескольких участках автомобиля, вы должны перемещать его по машине каждые 15 минут», — говорит он. «Чтобы его высохнуть, нужна вечность».

По его словам, чтобы полностью высохнуть, с обычной УФ-лампой потребовалось около часа. Но магазин также все повторно блокирует и переналаживает, что означает, что весь процесс занял два часа.

Это был не только длительный процесс, но и очень дорогие лампы и сопутствующие лампы. Коккаро говорит, что замена одной лампы может стоить примерно 800 долларов, помимо ламп за пару тысяч долларов.

«Я думал о том, как можно было бы обработать всю сторону машины одним выстрелом», — говорит он.

ЧТО ЭТО ДЕЛАЕТ: Именно тогда Коккаро пришло в голову, что солярий может помочь.

«Зная, что это тоже УФ, в основном это и произошло», — говорит он. «Я подумал, интересно, если вы разделите солярий пополам, если это действительно сработает».

По его словам, идея состоит в том, чтобы с каждой стороны солярия можно было высушить УФ-грунтовку со всей стороны автомобиля за один раз.

Сначала он говорит, что не был уверен, подойдет ли длина волны лампочек. У разных УФ-ламп разные длины волн, и он не знал, как они будут совпадать. Он посоветовался со своим другом и коллегой, владельцем магазина Роном Райхеном, владельцем компании Precision Body & Paint в Орегоне, и они решили поэкспериментировать с этим.

КАК ЭТО СДЕЛАНО: Коккаро купила старый солярий на Craigslist, отремонтировала его и разделила два ящика пополам. Затем он купил пару шкивов и проволоку, чтобы пропустить через шкивы, чтобы построить устройство, которое заставляет стороны солярия наклоняться и плавно перемещаться вверх и вниз.

Хотите верьте, хотите нет, но он говорит, что лампы в солярии работали отлично, и ему просто пришлось включить их, чтобы начать пользоваться машиной.

СТОИМОСТЬ: Коккаро приобрел солярий за 100 долларов, а необходимые шкивы и инструменты для его адаптации стоили
примерно 300 долларов. В целом, по его словам, на строительство потребовалось всего четыре или пять часов.

ROI: Коккаро окупается вдвойне. Во-первых, кровать намного дешевле светильников.Если лампочка в солярии сломается, ее замена стоит всего 40 долларов за штуку. Что еще более важно, по его словам, была невероятно экономия времени. Хотя старый способ использования небольших УФ-ламп занимал два часа, он говорит, что его сотрудники могут заправлять, повторно блокировать и повторно заправлять после высыхания в течение 30-40 минут.

«Солярий занимает почти всю часть автомобиля», — говорит он. «Работы намного меньше».

Вы работаете в сфере ремонта после столкновений и хотите продемонстрировать свои инновации или изобретения, которые помогли улучшить вашу работу? Щелкните здесь, чтобы отправить свое нововведение.