Льняное масло для: Льняное масло: польза, вред, как принимать

Биологически активная добавка Real Caps масло льняное холодного отжима 500мл

Льняное масло – исконно русский продукт, незаслуженно забытый, производство которого было вытеснено более дешёвыми и массовыми растительными маслами, хотя по своим полезным свойствам оно значительно превосходит их. Содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) омега-3 в льняном масле почти вдвое выше, чем в рыбьем жире. Можно сказать, что льняное масло является «живым продуктом», поэтому его нужно оберегать от нагрева и  воздействия прямых солнечных лучей.

Льняное масло предупреждает болезни сосудов и образование тромбов. Ежедневное употребление льняного масла способствует профилактике развития сердечных приступов, так как из-за уменьшения вязкости крови и нормализации уровня жиров в крови нагрузка на сердце снижается. Употребление в пищу ПНЖК способствует снижению показателей артериального давления. Льняное масло облегчает течение предменструального синдрома и пременопаузы, улучшает состояние кожи и волос, способствует заживлению повреждённых тканей. Масло семян льна обладает мягчительным, противовоспалительным, обволакивающим, мочегонным, лёгким слабительным, бактерицидным действием.

• Форма выпуска: жидкость во флаконах по 500 мл
• Состав: льняное масло первого холодного отжима нерафинированное, смесь токоферолов (антиокислитель).
• Содержание полиненасыщенных жирных кислот омега-3 (альфа-линоленовой кислоты) – не менее 50%.
• Область применения: рекомендуется в качестве биологически активной добавки к пище — источника полиненасыщенных жирных кислот омега-3.

В суточной дозировке содержится:

• Пищевая ценность в 100 г: белки — 0 г, углеводы – 0 г, жиры – 99,8 г.
• Энергетическая ценность в 100 г — 3760 кДж / 898 ккал.
• Рекомендации по применению: взрослым по 1 чайной ложке (5 мл) 1 раз в день время еды. Продолжительность приёма – 1 — 2 месяца. При необходимости приём можно повторить. Перед применением рекомендуется проконсультироваться с врачом.
• Противопоказания: индивидуальная непереносимость компонентов.
• Срок годности: 1 год.
• Условия хранения: Хранить в сухом, защищенном от прямых солнечных лучей и недоступном для детей месте при температуре не выше 25°С. После вскрытия упаковки хранить в холодильнике не более 60 суток.

Плюсы и минусы льняного масла для дерева

Древесина – природный материал, который под действием влажности, ультрафиолета, вредоносных микроорганизмов и насекомых быстро теряет свои характеристики. Чтобы этого не происходило, его обрабатывают защитными составами. Одно из них – льняное масло для дерева. Разберёмся, что собой представляет этот пропиточный материал, какими обладает свойствами, и как его правильно наносить, чтобы гарантировать высокое качество конечного результата.

Льняное масло для обработки древесиныИсточник ecodomstroj.ru

Что собой представляет льняное масло

Современный рынок строительных материалов предлагает достаточно широкий ассортимент защитных составов для древесины. Многие из них по своим техническим характеристикам превосходят льняное масло. Но последний своих позиций не сдаёт. Причины – экологичность материала, высокие антисептические свойства, плюс – возможность подчеркнут природную текстуру дерева.

К достоинствам можно добавить такое свойства, как заполнение микротрещин, которые образуются между волокнами. А известно, что именно в трещинах такого типа накапливается влага, которая снижает качества самого дерева. При этом льняное масло, проникая вглубь структуры древесины, повышает эластичность и пластичность верхнего слоя. А это защита от образования микротрещин.

Льняное масло – отличный водоотталкивающий слойИсточник impra.de

Образующаяся защитная плёнка – отличный водоотталкивающий слой. При этом молекулярная структура обеспечивает высокие адгезионные свойства. То есть, масло легко ложится на древесину, не отслаиваясь от неё. Добавим, что после высыхания образованная плёнка не поддерживает горение, что является немаловажным качеством для отделки деревянных изделий и конструкций. И ещё один плюс – небольшой расход. В среднем 60 г/м². Конечно, с учётом многослойности нанесения расход материала увеличивается. Но это зависит от пористости дерева. Чем оно мягче и пористее, тем расход масла больше, потому что впитывается и заполняет собой поры.

Сама пропитка из льна получается способом отжима льняных семечек. Технология может быть холодной или горячей. В первом случае семечки просто отжимают на прессе. Во втором, предварительно их подвергают температурному воздействию.

Существует определённая классификация этого материала в зависимости от количества примесей в нем:

• рафинированный с количеством примесей до 0,05%;
• нерафинированный с количеством примесей в пределах 0,05-0,15%.

Именно второй и используют для обработки деревянных конструкций и изделий.

Обработка деревянных изделий льняным масломИсточник ytimg.com

Рынок сегодня предлагает две модификации этого материала: чистое масло без добавок и с добавками. Последний вид называют олифой или пропиткой. Вторая отличается от первой тем, что масло проходит процесс термической обработки, а затем в него добавляют химические присадки. Последние необходимы для того, чтобы уменьшить время полимеризации материала. Обычными словами – процесс высыхания. Иногда олифу называют варёным маслом или кипячёным.

Обработка дерева маслом из льна – процесс несложный. Но необходимо учитывать низкую полимеризацию пропитки. Во-первых, защитный материал наносится в 5-7 слоёв в зависимости от пористости древесины. И каждый слой может сохнуть несколько дней, что увеличивает время на проведение защитных мероприятий для дерева. Во-вторых, пропитка активно впитывается в структуру древесины, отсюда и количество слоёв.

В-третьих, проникшее глубоко в тело деревянной конструкции льняное масло высыхает долго. А поверхностный слой быстро. Отсюда масляные пятна, которые все время проступают на поверхности. В-четвертых, высохший материал боится механических нагрузок. То есть, у него высокая истираемость. Царапины также часто появляются на обработанной поверхности.

Внимание! Масляный слой хорошо сохнет на солнце. Для этого требуется всего лишь несколько часов. Но от солнечных лучей материал темнее. Это не всем нравится.

Обработка деревянного пола льняным масломИсточник allegroimg.com

В этом плане олифа лучше. Она практически не впитывается в структуру древесины, оставляя на поверхности прочную плёнку. Быстрое высыхание – ещё один немаловажный плюс. И третье – даже под солнцем олифа не темнеет. Кстати, сохнет она в течение суток, если температура в пределах +20С, а влажность воздуха не превышает 80%.

Не смотря на достаточно большое количество недостатков, льняное масло для пропитки древесины мастера используют до сих пор. Им обрабатывают внешние и внутренние поверхности деревянных стен, потолки, посуду из дерева, мебель, окна и двери, игрушки и прочее. Особенно маслом этого типа пропитывают изделия и конструкции из ценных пород древесины. Таким способом долго сохраняются естественные качества и свойства дорогого дерева.

Пропитка льняным маслом деревянной мебелиИсточник roomester.ru

Правила нанесения льняного масла

Как и большинство строительных процессов, пропитка дерева льняным маслом делится на два этапа: подготовка и само нанесение. Процессы, входящие в подготовку:

• заделка щелей и трещин ремонтными составами;
• грунтовка, лучше алкидной;
• шлифовка поверхности;
• обеспыливание, лучше компрессором, то есть струёй воздуха под давлением;
• очистка – обычно обрабатывают уайт-спиритом;
• если льняным маслом обрабатывается сруб, то его предварительно обрабатывают антисептиком.

Внимание! Влажность древесины не должна превышать 15%. В противном случае льняное масло не будет впитываться в структуру изделия, будет долго сохнуть.

Нанесение масла тампономИсточник ales-spb. ru

Пропитка для дерева от влаги и гниения: какая лучше для наружных и внутренних работ

Что касается непосредственного процесса обработки, то делают это кисточками, валиками или тампонами. Наносят масло равномерным слоем вдоль волокон древесины. После чего в течение получаса дают возможность материалу впитаться. Далее удаляют с поверхности излишки и оставляют на высыхание. Следующий слой наносится только после полной полимеризации предыдущего. После чего последний слегка шлифуют.

Поверхности деревянных конструкций, которые эксплуатируются на улице, часто дополнительно обрабатываются воском. Это увеличивает и срок службы, и долго сохраняет природный внешний вид.

Внимание! Равномерное нанесение льняного масла – залог высокого качества конечного результата. Нельзя допускать, чтобы на поверхности обрабатываемой древесины образовались масляные пятна.

В видео показан процесс обработки дерева льняным маслом:

Сегодня производители предлагают большой ассортимент минеральных масел для дерева на основе льняной составляющей. Относят их к категории профессиональных пропиток. Отличаются они от чистого масла добавками. Обычно это воск, смолы, пластификаторы, антисептики, антипирены, ускорители высыхания, пигменты и прочее. Классифицируются эти пропитки на две группы: для внешних и внутренних работ.

Особой популярностью среди мастеров пользуются пропитки с добавлением воска. Это на самом деле высококачественный материал среди себе подобных. Им обычно обрабатывают поверхности деревянных конструкций, которые подвергаются интенсивным нагрузкам. К примеру, лестницы, полы, двери и некоторые виды предметов мебели.

И ещё один момент, который можно отнести к преимуществам пропиток этого типа. Покрытое льняным маслом дерево со временем истирается, теряет свой первоначальный цвет, появляются на поверхности царапины и прочие мелкие дефекты. Исправить эти недочёты можно легко. Для этого старую обработанную поверхность шлифуют мелкозернистой наждачной бумагой и наносят слой масла. Последний скроет собой все неприятные моменты и придаст древесине новый привлекательный внешний вид.

Реставрация старой мебели льняным масломИсточник wp.com

Особенности лаков на акриловой основе в зависимости от состава

Другие разновидности масляных пропиток

Льняное масло для пропитки дерева – не единственное, что предлагают производители. Есть и другие разновидности.

Тунговое масло

Этот древний продукт известен, как защитная пропитка для древесины от разных жучков, гнили и влаги. Поэтому в старину им обрабатывали не только полы и стены, а также мебель и деревянную утварь.

Сегодня тунговое масло продаётся во всех строительных магазинах и является востребованным. Способ нанесения практически не отличается от льняного. А именно:

• нанесение возможно при температуре не ниже +15С, при низких оно густеет, что усложняет процесс пропитки;
• материал наносят кисточкой, затем минут двадцать дают настояться и растирают деревянную поверхность губкой, равномерно распределяя по всей площади;
• разрешается разбавлять масло уайт-спиритом до 40%, это увеличивает впитываемость материала.

Тунговое масло для обработки древесиныИсточник nojinsk.ru

Экологичные краски и пропитки Perma-Chink Systems – для деревянных домов

Тиковое

Никакого отношения это масло к дереву «тик» не имеет. Изготавливают его из двух разновидностей масел: льняного и тунгового с добавлением соснового скипидара очищенного типа. Это готовый к использованию продукт. Ничего в него добавлять не надо.

Это универсальный материал, поэтому его можно использовать как для внутренних, так и для наружных работ. Особенно это касается беседок, навесов, уличной мебели и предметов ландшафтного дизайна. Конечно, им обрабатывают мебель и другие изделия из дерева.

Тиковое масло для пропитки древесиныИсточник mymebel.in.ua

Дегтярное

Этот тип масла для обработки древесины является самым мощным антисептиком. Его часто называют «террасным». Изготавливают на основе льняного и тунгового масла с добавлением сосновой канифоли, скипидара и соснового дёгтя. От последнего и происходит название.

Обычно его используют для обработки деревянных конструкций и предметов, эксплуатируемых на улице. По способу нанесения ничем не отличается от предыдущих разновидностей. Добавлять в масло другие компоненты не рекомендуется.

Террасное масло для наружных работИсточник goods.ru

Пропитка для бани внутри: особенности защиты различных поверхностей и применяемые составы

Коротко о главном

Льняное масло используют для обработки деревянных поверхностей, чтобы создать влагозащитную плёнку и закрыть мелкие дефекты.

Наносят масло на подготовленную поверхность: отшлифованную, чистую и сухую.

Для нанесения используют кисточки, валики или губки.

Для обработки больших поверхностей используют пульверизатор. Главная задача производителя работ – нанести материал равномерно.

Кроме льняного масла производители предлагают тунговое, тиковое и дегтярное.

рецепты для красоты и здоровья

Льняное масло — источник здоровья и красоты

В последнее время практически ни один рейтинг продуктов здоровья не обходится без льняного масла. Так ли оно полезно, как его расхваливают? Что в нем особенного и что важно знать об этом продукте?

Целебное семя

Льняное масло получают из семян льна путем холодного отжима, что позволяет полностью сохранять их ценные качества. В зависимости от степени очистки цвет масла может меняться от янтарного до коричневого. При этом продукт высшего сорта — кристально чистый, без мутных взвесей и осадка. Запах у него нейтральный. А вот вкус льняного масла вызывает смешанные чувства. Его отличают специфическая горчинка и легкий привкус рыбьего жира. Если вместо них ощущается прогорклость, масло безнадежно испорчено. Как ни печально, хранится оно не дольше года. Поэтому выбирайте небольшие по объему емкости с маслом, обязательно из темного стекла. В открытой таре оно будет полезным не дольше 2 месяцев, при условии что хранится в холодильнике.

Коктейль здоровья

Ударная сила льняного масла заключена в жирных кислотах омега-3 и омега-6. Они питают и регенерируют ткани, обеспечивают бесперебойную работу практически всех систем организма. Самый ценный витамин льняного масла — витамин E. Это мощный антиоксидант, который в буквальном смысле наполняет каждую клетку молодостью и энергией, так что звание витамина молодости и красоты оправдывает вполне. Помимо этого, в составе льняного масла — витамины группы B, которые обычно встречаются в продуктах животного происхождения. За это оно и заслужило горячую любовь вегетарианцев. А еще масло богато витаминами A, D, K, PP и жизненно важными минералами: калием, кальцием, магнием, фосфором, цинком, селеном, железом и натрием.

Масло как лекарство

Полезные свойства льняного масла делают его не только ценным продуктом, но и лекарственным средством. Замечено, что его регулярное употребление снижает риск возникновения диабета, атеросклероза и рака различных видов. А ведь именно эти болезни возглавляют список самых распространенных недугов на планете. Существенна польза льняного масла для органов пищеварения, поскольку оно обладает желчегонным и противовоспалительным свойством. Последнее весьма полезно при лечении артрита, артроза и при любых проблемах с суставами. Благотворно влияет льняное масло на мозг и нервную систему. Оно улучшает мыслительные процессы, помогает справляться с эмоциональными нагрузками и даже улучшает настроение. Вдобавок льняное масло —  настоящий природный иммуностимулятор.

Женское счастье

Почти любой диетолог подтвердит, что, выбирая льняное масло для похудения, вы добьетесь желаемых результатов гораздо быстрее. Секрет кроется все в тех же насыщенных жирах, которые налаживают работу кишечника и ускоряют обмен веществ. Уменьшая потребление калорий, мы недополучаем важные питательные элементы, тогда как всего 2 ст. л. льняного масла в день помогут с легкостью восполнить их запасы. А еще льняное масло помогает переносить стресс и депрессию без вреда для себя и окружающих. Добавим, что польза льняного масла для женщин исключительна. Частое его употребление нормализует гормональный баланс, смягчает течение ПМС и менструальные боли, эффективно борется с симптомами климакса.

Тонкий акцент

Как употреблять льняное масло с максимальной пользой? Самый простой способ — выпивать по 1 ч. л. масла натощак и перед сном, запивая его небольшим количеством теплой воды. Но куда приятнее добавлять его в различные блюда. Главное, не подвергайте его термической обработке. А еще из льняного масла готовят сложные заправки. Смешиваем 2 ст. л. лимонного сока, 1½ ст. л. соевого соуса, 1 ч. л. кленового сиропа и 4 ст. л. льняного масла. Рецепт этой универсальной заправки подарит любимым овощным салатам новые нотки и сделает их еще полезнее. Кстати, это масло органично сочетается с творогом. Взбиваем в блендере 250 г обезжиренного творога, 2 ст. л. льняного масла, горсть любых сухофруктов и орехов — вкусный и здоровый завтрак готов.

Преображение с блеском

Исторические хроники свидетельствуют, что древнеегипетские красотки умело использовали льняное масло для сохранения молодости. Вы можете добавить пару капель масла в уже готовые кремы. Но лучше всего сделать из него домашние маски. Смешиваем яичный желток, 1 ст. л. сметаны, 1 ч. л. сухой измельченной цедры лимона и 1 ст. л. льняного масла. Наносим смесь на лицо на 20 минут, а затем смываем прохладной водой. Эта маска отлично увлажняет и тонизирует кожу, делает ее подтянутой и сияющей. Поможет льняное масло и при выпадении волос. Для этого натираем на терке луковицу, смешиваем ее с 1 ст. л. меда и 1 ст. л. льняного масла. Втираем маску в кожу головы, укутываем на 30 минут, после чего промываем настоем ромашки. 

Каким бы полезным ни было льняное масло, оно все же может нанести вред здоровью. А потому перед тем, как включать его в семейный рацион, убедитесь, что ни у кого из домочадцев нет индивидуальной непереносимости. 

Льняное масло для волос от выпадения

Масло из льняных семян используют в кулинарии, народной медицине и индустрии красоты для приготовления уходовых средств за волосами. При правильном использовании оно возвращает проблемным, ослабленным прядям здоровье и силу.

Корейскими учеными был разработан инновационный продукт для стимуляции роста волос — Pelo Baum. Pelo Baum это линия средств где основой являются пептиды. Пептиды, они же факторы роста, это молекулы белка, которые вырабатываются в каждом организме, их роль заключается в стимуляции восстановительных процессов. Пептиды встраиваются в естественный механизм роста волос, запускают процесс роста волосяного фолликула и деления клеток, замедляют процесс старения клеток, удлиняют фазу активного роста и сокращают фазу отдыха волос. Помимо группы пептидов Pelo Baum содержит экстракты трав и витамины. Подробнее о Pelo Baum — https://doctorhair.ru/statii/vypadenie-volos/pelo-baum-dlja-rosta-volos/

Состав и полезные характеристики

Используя метод холодного отжима в переработке льняных семян, получают полезное, насыщенное витаминами и микроэлементами масло. Оно включает все вещества, которые необходимы для здоровья волос. Это 5 натуральных кислот (линоленовая, стеариновая, линолевая, олеиновая, пальмитиновая), витамины В4, В9, В2, Е, РР, К, калий, кальций, цинк. Продукт на организм воздействует таким образом:

• улучшает работу иммунитета, пищеварительного тракта;
• выводит токсины;
• предотвращает развитие раковых опухолей;
• снижает концентрацию «плохого» холестерина;
• нормализует давление;
• защищает сердечно-сосудистую систему от атеросклероза;
• повышает эластичность сосудов;
• выступает профилактикой диабета.

А еще в масле семян льна содержится редкий углеводород сквален, замедляющий возрастные изменения организма. Регулярное употребление масла льна продлевает молодость, сохраняет свежесть кожи, уменьшает выраженность морщин и способствует похудению.

Как выбрать масло льна

Натуральное вещество, полученное с соблюдением технологии, имеет светло-желтый или коричневатый оттенок. На вкус оно мягкое, немного терпкое, без выраженной горечи или запаха. Неприятные горькие нотки свидетельствуют о некачественном или испорченном продукте. Отсутствие вкуса и запаха говорит о предварительной обработке, что снижает полезные характеристики. Осадок или посторонние примеси в качественном продукте недопустимы.

Льняное масло не требует дополнительного обогащения полезными веществами. Любые упоминания о витаминных добавках – маркетинговый ход, призванный увеличить стоимость товара. Покупать продукт лучше в маленьких емкостях, т. к. в открытом виде он хранится не дольше 2-3 месяцев. Солнечный свет сокращает срок годности, поэтому следует покупать масло, разлитое в темные бутылки.

Как применять: рекомендации

Вариантов наружного применения данного продукта может быть несколько. Его добавляют в шампуни, домашние маски, используют, как моно-средство. Главное – правильно дозировать продукт. Он имеет плотную структуру, поэтому может утяжелять волосы и закрывать поры дермы головы. Масло распределяют по сухим прядям, если другое не указано в рецепте.

Маслянистый продукт льна редко вызывает аллергию, но перед применением стоит провести тест. Несколько капель жидкости наносят на нежную кожу локтевого сгиба. Если спустя 10 минут зуд, покраснение или другие реакции отсутствуют, продукт можно использовать.

Польза льна для волос

Льняное масло подходит любым волосам, но максимальная польза отмечается для сухих прядей, ослабленных термической укладкой, химическим воздействием или другими негативными факторами. Его полезные качества для здоровья волос:

1. регенерация структуры;
2. увлажнение, питание, «запаивание» секущихся кончиков;
3. активизация роста;
4. восстановление кожного покрова головы, заживление ран, уменьшение воспалений;
5. возвращение эластичности и блеска;
6. стимуляция выработки коллагена;
7. удержание влаги внутри волосяного стержня;
8. устранение ломкости, зуда, шелушения;
9. защита от грибков, бактериальных инфекций, негативных внешних факторов;
10. борьба с перхотью.

Благодаря уникальному составу, продукт рекомендуют использовать наружно и внутрь. При комплексном использовании результаты будут заметны быстрее.

Топ-5 масок

Элементарный способ применения масла семян льна – обработать им волосы, отступив 2-3 см от корней. Кончикам, особенно если они посеченные или сухие, уделяют более пристальное внимание. Волосы закрывают шапочкой, утепляют, выдерживают 2-2,5 часа. Затем вещество смывают обычным способом.

Можно добавлять продукт в домашние маски, дополняя его другими ингредиентами. Как и прочие натуральные средства, масло льна дает накопительный эффект. Регулярные процедуры, направленные на укрепление волос, рекомендованы 2-3 раза в неделю. Длительность курса – 1-2 месяца.

Для активации роста

В основе средства – луковый сок, обладающий раздражающим эффектом. Его действие пробуждает неактивные фолликулы, активизирует кровообращение, способствует эффективному насыщению тканей полезными веществами. Льняное масло в сочетании с медом насыщает волосы полезными компонентами, увлажняет их, возвращает здоровый вид.

Ингредиенты:

• 1 небольшая луковица;
• 2 ст. л. масла семян льна;
• 1 ст. л. жидкого меда.

Лук измельчить в кашицу (на терке, с помощью блендера), взять 3 ст. л. сырья, отжать сок. Указанные пропорции масла и меда подогреть, смешать с остальными компонентами, нанести на поверхность дермы головы. После утепления полиэтиленовой шапочкой и полотенцем выдержать 40 минут, смыть легким шампунем. Избавиться от неприятного лукового запаха помогут средства с цитрусовыми отдушками.

Восстанавливаем структуру волосяного ствола

Аптечный глицерин восстанавливает структуру поврежденного волосяного стержня, возвращает эластичность, «заклеивает» посеченные кончики. Эфирные масла помогут усилить эффект. Для сухих волос рекомендуется эвкалипт или грейпфрут, нормальным прядям или склонным к сухости – иланг-иланг, лаванда. Компоненты:

• 2 ст. л. масла льняных семян;
• 1 ст. л. глицерина;
• 2-3 капли подходящего эфирного масла.

Составляющие маски хорошо перемешать, нанести на волосы, утеплить. Выдержать несколько часов, если структура сильно повреждена – всю ночь. Смыть обычным методом.

От повышенной жирности

В желтке содержится коллаген – вещество, выступающее «строительным материалом» для волос. Коньяк активизирует кровообращение и расширяет сосуды, благодаря чему питательные компоненты эффективней проникают в структуру. Маску рекомендуют для жирных волос, а для сухих прядей количество спиртного следует уменьшить вдвое. Компоненты маски:

• 5 ст. л. коньяка;
• 1 желток;
• 2 ст. л. масла льна.

В подогретое масло влить остальные компоненты, смешать. Старательно распределить по прядям, утеплить. Через полчаса смыть шампунем.

От алопеции

Для средства понадобится свежий корень лопуха. Его можно выкопать (необходимо растение, которое находится вдали от дорог и промышленных предприятий) или купить (иногда сырье продается на рынках). Лопух укрепляет волосы, ускоряет рост, лечит кожные заболевания. Состав средства:

• 100 г корня лопуха;
• 4 ст. л. масла льна.

Измельчить корень, соединить с маслом, перемешать. Настаивать сутки в тепле, прогреть на водяной бане, профильтровать. Нанести на пряди, утеплить плотным полотенцем, вымыть голову легким шампунем через 1,5 часа.

Для увлажнения

Помимо желтка, который регенерирует структуру волосяного стержня, в состав маски добавляют молоко и мед. Они увлажняют пересушенные пряди, удерживают влагу внутри, благодаря чему волосы выглядят здоровыми, эластичными. Компоненты средства:

• 1 ч. л. масла льна;
• 1 желток;
• 1 ч. л. меда;
• 100 мл молока.

Масло и мед слегка нагреть (до 25С0). Добавить остальные продукты, взбить, нанести на волосы (предварительно мыть и увлажнять их не нужно). Держать 10-30 минут, тщательно смыть водой.

Особенности приема масла внутрь

Натуральный продукт употребляют в пищу и используют наружно. Для укрепления организма, предупреждения заболеваний, восстановления волос и дермы масло принимают по 10-15 мл 1-2 раза в день за час до приема еды. Его добавляют в блюда, не подвергая термической обработке. Максимальный эффект достигается после 3-4 месяцев приема, затем важно сделать перерыв на 1-2 месяца.

Противопоказания

При наружном применении льняное масло не вызывает отрицательных реакций. Исключение – гиперчувствительность к продукту. Отказаться от приема внутрь следует при:

• беременности, лактации;
• возрасте до 14 лет;
• аллергии на продукт;
• панкреатите, патологиях печени и поджелудочной железы;
• нарушениях свертываемости крови;
• мочекаменной болезни;
• эндометриозе, гипотериозе, гипертериозе;
• подготовке к хирургическим операциям (из-за повышенного риска кровотечений).

Превышать дозировку (1-2 ст. л. в день) не рекомендуется – это может привести к неприятным последствиям (расстройствам ЖКТ, тошноте, метеоризму, колитам, аллергической сыпи).

границ | Добавление льняного масла в рацион ягнят в раннем возрасте приводит к стойким изменениям в структуре микробиома рубца

Введение

Жвачные животные, такие как крупный рогатый скот и овцы, полностью полагаются на микроорганизмы в рубце, которые разлагают волокнистый корм и позволяют им получать питательные вещества из пищи. Микробиом рубца состоит из миллиардов взаимодействующих видов бактерий, простейших, архей, грибов и бактериофагов, которые совместно переваривают клетчатку, крахмал, жиры и сахара и производят летучие жирные кислоты (ЛЖК), прежде всего ацетат, бутират и пропионат (Hobson and Stewart). , 1997).Кроме того, микроорганизмы служат источником белка и витаминов группы В для хозяина. Взамен животное обеспечивает теплую, стабильную и влажную среду с постоянным поступлением питательных веществ, что позволяет микробам процветать (Nocek and Russell, 1988; Hobson and Stewart, 1997; Russell and Rychlik, 2001; Chaucheyras-Durand and Ossa, 2014). ).

В качестве побочного продукта переваривания корма микроорганизмы рубца также производят соединения, которые не могут быть использованы хозяином, такие как двуокись углерода и водород. Если водород накапливается в рубце, это может быть опасно для здоровья животного и приводить к вздутию живота и снижению ферментации корма.Метаногены, группа архей, борются с этой проблемой, восстанавливая водород до метана (CH ₄ ), который затем удаляется из организма при отрыжке (Hobson and Stewart, 1997). Это приводит к повышенному содержанию метана в атмосфере и потере энергии животным на 2–13 %, что влияет на эффективность кормления в животноводстве (Johnson and Johnson, 1995).

За последнее десятилетие структура микробного сообщества в преджелудке жвачных животных все больше связана с тенденциями эффективности кормления, выбросами парниковых газов (ПГ) и здоровьем хозяина.Стало ясно, что определенные микробные профили рубца способствуют повышению эффективности кормления и снижению выбросов парниковых газов (Wanapat et al., 2015). Ряд подходов, таких как повышение качества корма, увеличение соотношения концентрата и фуража, использование модификаторов рубца, таких как дефаунизация или ингибиторы метаногенеза (например, мевастатин), использование агентов, повышающих продуктивность, таких как ионофоры, и использование липидов или жирных кислот в качестве пищевых добавок. добавки были исследованы как средство манипулирования микробиомом рубца для достижения конкретных результатов (Boadi et al., 2004; Кнапп и др., 2014; Каро и др., 2016). Хотя эти стратегии имели разный уровень успеха, неоднократно было показано, что диета сильно влияет на микробную структуру рубца (de Menezes et al. , 2011; Ellison et al., 2014; Cobellis et al., 2016). Например, Петри и др. (2013) сообщили о значительных различиях в структуре бактериального сообщества рубца у взрослого крупного рогатого скота, получавшего фуражный рацион, по сравнению с животными, получавшими рацион с высоким содержанием концентратов, в то время как Kocherginskaya et al. (2001) описали различия в составе бактериального сообщества при кормлении крупного рогатого скота сеном по сравнению с кормлением кукурузой.

Сообщается, что добавление в рацион жвачных животных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) снижает метаногенез в кишечнике (Martin et al., 2008; Petrie et al., 2009; Guyader et al., 2015). Соевое масло и льняное масло, пищевые добавки на растительной основе, богатые ПНЖК (кислоты n-6 и кислоты n-3 соответственно), снижали выбросы кишечного метана без влияния на производство молока при введении в рацион крупного рогатого скота (Rowntree et al. , 2010). Лиллис и др. (2011) сообщили о значительных различиях в составе бактериального сообщества и количестве метаногенов в рубце крупного рогатого скота, получавшего соевое масло, по сравнению с теми, кто этого не делал. Кроме того, у крупного рогатого скота, которого кормили соевым маслом, уменьшилось разнообразие видов грибов в рубце (Boots et al., 2013). Эти исследования стимулировали интерес к использованию диеты для изменения структуры микробиома рубца для достижения определенных результатов, таких как снижение выбросов парниковых газов, повышение эффективности корма и т. д. Однако пищевые добавки являются дорогостоящими, и их долгосрочное использование может быть экономически невыгодным или коммерчески нецелесообразным.

Кроме того, однажды установленный зрелый микробиом рубца является довольно стабильным и устойчивым, и в настоящее время сообщается, что диетические вмешательства приводят только к непостоянным или кратковременным изменениям в микробной структуре рубца (Yáñez-Ruiz et al., 2015). На сегодняшний день многие вмешательства, такие как применение антибиотиков и добавление пробиотиков, не увенчались успехом, при этом состав микробиома и профиль ферментации возвращаются к составу до лечения после прекращения лечения (Weimer et al. , 2010). Фактически, Weimer et al. (2010) показали, что даже когда все содержимое рубца было вручную удалено у одной коровы и заменено пищеварением рубца, полученным от коровы с другим микробным профилем рубца, микробиом рубца не оставался измененным.Хотя профиль напоминал профиль донора сразу после переноса, к следующей дате отбора проб (через 62 дня) микробный профиль рубца напоминал исходный.

Хотя рубец не функционирует сразу после рождения, колонизация начинается сразу же, при этом бактериальные сообщества, как сообщается, достигают определенной степени стабильности через 3–4 недели (Abecia et al., 2014a; Rey et al., 2014; Guzman et al., 2015). Это говорит о том, что период после рождения может иметь решающее значение для формирования микробиома рубца для получения долгосрочных и стабильных результатов.Абесия и др. (2014b) кормили детей и соблюдали диету с добавлением бромхлорметана (BMC) в течение первых 3 месяцев жизни и первых 2 месяцев после родов, соответственно, и сообщили о стойких изменениях микробиома рубца у детей через 3 месяца после диетического вмешательства. прекратился. BMC использовали из-за его способности снижать выработку кишечного метана у жвачных животных, однако коммерческое использование BMC было запрещено Европейским союзом в июне 2000 г. необходимо альтернативное, менее токсичное соединение.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы проверить гипотезу о том, что пищевые добавки в раннем возрасте окажут значительное влияние на состав бактериального и архейного сообщества рубца, который будет сохраняться даже после прекращения приема добавок. Добавкой, используемой в этом исследовании, было льняное масло, поскольку оно нетоксично и, как было показано ранее, снижает выбросы кишечного метана на 64% (Martin et al., 2008; Rowntree et al., 2010) и, таким образом, может иметь потенциал. в сокращении выбросов парниковых газов от сельского хозяйства.Новорожденных ягнят разделили на три лечебные группы в зависимости от рациона. Одну группу ягнят кормили стандартной мукой для ягнят (контрольная группа), вторую группу ягнят кормили только добавкой льняного масла перед отъемом (4 недели), а затем переводили на контрольный рацион (группа LP), а третья группа (группа L) получала добавку льняного масла до и после отъема (~14 недель). Через 16 недель ягнят забили, и микробные сообщества рубца всех ягнят были проанализированы, чтобы определить, оказывает ли эффект добавка льняного масла и сохраняется ли этот эффект после прекращения приема пищевых добавок.

Материалы и методы

Экспериментальный проект

Все описанные процедуры были проведены по экспериментальной лицензии Министерства здравоохранения Ирландии в соответствии с Законом о жестоком обращении с животными 1876 г. и Постановлениями Европейского сообщества (поправки к Закону о жестоком обращении с животными 1876 г.) 1994 г. Двадцать тройняшек от овец В текущем исследовании использовалось стадо из Университетского колледжа Дублина, Lyons Research Farm, Newcastle, Co., Дублин, Ирландия. Все овцематки были выведены методом искусственного осеменения и ягнятся с интервалом в 1 день друг от друга.

Через 24 часа после родов в исследование были включены 20 тройняшек, несущих и выращивающих маток. Овец блокировали по общей массе приплода (11,6 ± 1,51 кг), а лечение уравновешивали по живой массе матерей при родах. План эксперимента представлял собой факторный план 2 × 2. От рождения до 6 недель после отела овцам (и ягнятам) предлагали корм на основе травяного силоса плюс один из двух типов концентратов (с льняным маслом (L) или без льняного масла (C)). После отъема ягнятам предлагали один из двух типов концентратов, описанных выше, для 100% удовлетворения их потребностей в питательных веществах.Это привело к четырем видам диетического питания после отъема: C: концентрат без льняного масла, скармливаемый как до, так и после отъема, L: концентрат, содержащий льняное масло, скармливаемый как до, так и после отъема, LP: концентрат с льняным маслом, скармливаемый до отъема, и концентрат без льняного масла. скармливание после отъема, L-POST: концентрат без льняного масла, скармливаемый до отъема, и концентрат, содержащий льняное масло, скармливаемый после отъема.

Контрольный рацион содержал 47,5% ячменя, 27% соевой муки, 10% мякоти цитрусовых, 9% соевой шелухи, 4% минералов и витаминов и 2.5% тростниковой патоки в пересчете на сырой вес. Для льняной диеты уровень включения ячменя был снижен на 4% и заменен 4% льняным маслом. Овец и ягнят содержали в загонах с соломенной подстилкой, и в течение первых 2 недель испытания ягнята имели импровизированный доступ к овечьему молоку. Овец кормили 3 кг концентратов на голову в день, которые постепенно снижали до 1,5 кг на голову в день в течение нескольких недель вплоть до отъема. В возрасте 2 недель в углу каждого загона создавали проход, доступ к которому имели только ягнята. Ягнятам предлагались импровизированные концентраты криповой муки в зависимости от диеты, на которой они находились.

Среднее потребление корма ягнятами рассчитывалось каждое утро. Ежедневно измеряли взвешивание корма и усредняли его среди всех подопытных ягнят. Ягнятам предлагались импровизированные концентраты и вода. Примерно в 6-недельном возрасте, когда среднее потребление ягнят превышало 550 г в день, ягнят отнимали от груди, а овец выводили из загонов. После отъема половину ягнят с контрольной диеты (C) переводили на льняную диету (L) и наоборот. Это привело к четырем описанным группам лечения, три из которых были проанализированы в текущем исследовании (C, L и L-P).Каждая из этих лечебных групп состояла из 15 ягнят, 9 из которых были проанализированы в этом исследовании, в результате чего было проанализировано в общей сложности 27 ягнят.

Все группы были сбалансированы по живой массе (19 кг ± 3,2) и полу. Ягнятам давали 7-дневный период адаптации к рациону. В возрасте 8 недель ягнят переводили в отдельные загоны, где регистрировали потребление сухого вещества (DMI). Ягнятам предлагали импровизированные концентраты примерно на 110% от их DMI по сравнению с предыдущим днем. В течение опытного периода еженедельно регистрировали живую массу на калиброванных электронных весах Tru-Test SR 3000 (Tru-Test Ltd., Окленд, Новая Зеландия). Весы калибровали каждый раз с известными весами.

После достижения живой массы 41 кг (± 2,1 кг) примерно через 111 (± 14) дней ягнята были доставлены в компанию Kildare Chilling Co. (Килдэр-Таун, графство Килдэр, Ирландия) для убоя. Желудок вскрывали и удаляли твердую переваренную массу рубца, сдавливали между двумя слоями марли и аликвоту 8 мл из полученной собранной жидкости рубца переносили в маркированный пластиковый флакон, содержащий 2 мл трихлоруксусной кислоты (50%).Затем этот образец замораживали при -20°C для анализа VFA и NH ₃ . Нефильтрованные твердые вещества рубца собирали из 6 участков рубца, объединяли и хранили при -80°C для микробного анализа.

Анализ летучих жирных кислот

Образцы жидкости рубца анализировали на концентрацию ЛЖК с помощью газовой хроматографии (Varian 3800, газовый хроматограф) с использованием капиллярной колонки CP-wax 58, 25 м × 0,53 мм (Varian BC, Нидерланды), как описано ранее Hart et al. (2009).

Экстракция ДНК и анализ микробного сообщества

ДНК экстрагировали из лиофилизированных нефильтрованных твердых образцов рубца от всех 9 животных в каждой экспериментальной группе (всего 27 образцов) с использованием метода PCSA, описанного Lueders et al. (2004), с добавлением фенола-хлороформа перед стадией взбивания шариков и хранением при -20°C до использования. Концентрацию и чистоту ДНК оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop ^TM (Thermo Scientific, Waltham, MA, США).

Структуры сообществ бактерий и архей были проанализированы с использованием секвенирования ампликонов на платформе Illumina Miseq с использованием метода, описанного Kozich et al. (2013). Вкратце, после выделения и очистки ДНК 1 мкл целевой ДНК добавляли в лунку 96-луночного ПЦР-планшета, уже содержащую 17 мкл Accuprime Pfx Supermix (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Дублин, Ирландия) и 2 мкл набора праймеров. нацеливаясь на область V4 гена 16S рРНК (Kozich et al., 2013). Условия ПЦР включали горячий старт при 95°С в течение 2 мин, затем 95°С в течение 20 с, 55°С в течение 15 с и 72°С в течение 5 мин (30 циклов) с конечной элонгацией 72°С в течение 10 минут. Продукты ПЦР визуализировали на 1,2% (масса/объем) агарозном геле (Roche Diagnostic, Базель, Швейцария).

Затем продукты ПЦР

очищали и нормализовали с использованием набора для нормализационных планшетов SequalPrep (Invitrogen, Thermofisher, Waltham, MA, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК определяли с использованием флуорометра Qubit и набора для двухцепочечной ДНК (Thermofisher Scientific, Дублин, Ирландия), чтобы обеспечить наличие концентрации ≥100 нг.Затем пул ампликонов был отправлен в Центр геномных исследований Ливерпульского университета для секвенирования на платформе Illumina Miseq. Файлы последовательностей, связанные с каждым образцом, были отправлены в архив чтения последовательностей NCBI (номер доступа PRJNA393972).

Данные секвенирования MiSeq первоначально обрабатывались с использованием программы mothur, разработанной Schloss et al. (2009). Последовательности адаптера Illumina были обрезаны с помощью cutadapt вер. 2.1.1 с использованием опции -O 3. Серп вер. 1.2 использовался для дальнейшей обрезки данных с оценкой качества ≥20. Прочтения <10 п.н. после обрезки были удалены. Затем каждое чтение было обрезано до максимальной длины 275 п.н., а неоднозначные основания были удалены. Последовательности, которые содержали гомополимерные циклы >8 оснований, отбрасывали. После обрезки идентичные последовательности были сгруппированы в «уникальные» последовательности. Химерные последовательности идентифицировали с использованием алгоритма UCHIME в mothur, а затем удаляли. Последовательности были отнесены к операционным таксономическим единицам (OTU) с использованием команды «кластер» и алгоритма среднего соседа. Все последующие анализы на основе OTU проводились с порогом 0.03. Таксономия была присвоена всем остальным выровненным последовательностям путем независимого сравнения обработанных данных с базами данных silva для бактерий и архей.

Статистический анализ

Групповые средние значения были рассчитаны для концентраций ЛЖК, среднего дневного потребления корма и среднесуточных привесов в экспериментальных группах. Дисперсионный анализ (ANOVA) и тесты post hoc , Tukey HSD проводились в программной среде R с использованием пакета «lsmeans» для анализа различий между средними значениями.Многомерный анализ проводили с помощью программы PRIMER-E v.7 с надстройкой PERMANOVA. Матрицы подобия были построены для образцов с использованием подобия Брея-Кертиса на стандартизированных данных о численности, преобразованных в четвертый корень. Затем был проведен основанный на расстоянии пермутационный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA; Anderson et al., 2001) для проверки нулевой гипотезы об отсутствии различий в структуре микробного сообщества при разных обработках при уровне значимости α = 0,05 на основе 9999 возможных перестановок. .Графики nMDS были построены для визуализации данных. Проценты сходства (SIMPER) рассчитывались с использованием сходства Брея-Кертиса для оценки уровня вклада каждой семьи в различия в структурах сообщества между группами. Эффекты и различия объявлялись значимыми, если p ≤ 0,05, и тенденциями, если p ≤ 0,2.

Результаты

В возрасте 2 недель двадцати семи ягнятам был предложен импровизированный доступ либо к стандартной муке из ягнятины (контрольный рацион), либо к стандартной муке из ягненка с добавлением 4% льняного масла (льняная диета).После отъема (примерно 6-недельного возраста) половину ягнят, получавших льняное питание (9 животных), переводили на контрольный рацион без добавок, в то время как остальные (9 животных) продолжали получать льняное питание. Ягнята на контрольном рационе (9 голов) продолжали получать стандартную баранью муку в течение всего периода исследования. Дополнение стандартного рациона ягнят льняным маслом (40 г/кг ^-1 DM) не оказало существенного влияния ни на среднесуточное потребление ( p = 0,11), ни на среднесуточный прирост веса ( p = 0.437) ягнят (дополнительный рисунок S1).

Ягнят забили через 16 недель и исследовали влияние рациона на профили ЛЖК в рубце и структуры сообщества бактерий и архей. ДНК экстрагировали из твердого вещества рубца всех животных и конструировали библиотеки ампликонов на основе области V4 гена 16S рРНК и секвенировали с использованием платформы Illumina MiSeq. После первоначальной обработки было получено в среднем 52 672 последовательности хорошего качества с порядковыми номерами на образец в диапазоне от 3 043 до 148 437 (медиана 36 260).Всего во всех выборках было идентифицировано 265 уникальных OTU, которые можно таксономически отнести к родовому уровню.

Микробиом рубца ягненка

Двадцать три различных типа бактерий были идентифицированы в рубце контрольной группы ягнят, которых на протяжении всего исследования кормили стандартной бараньей мукой. Bacteroidetes (39,43%) и Firmicutes (34,29%) доминировали в микробиоме рубца этих ягнят через 16 недель после рождения. Относительная численность Proteobacteria также была высокой (16.64%) в развивающемся рубце (дополнительная таблица S1).

Из бактериальных родов, обнаруженных в рубце ягненка, относительная численность Prevotella была самой высокой, составляя 31% от общего числа бактериальных последовательностей (рис. 1А), и еще 7% бактериальных последовательностей были связаны с неклассифицированными членами этого рода. семья. Другими родами бактерий, которые присутствовали в относительно большом количестве в рубце этих ягнят, были неклассифицированные роды из Gammaproteobacteria (13%), Lachnospiraceae (12%) и Veillonellaceae (9%). Succinivibrio , Succiniclasticum и неклассифицированные роды Firmicutes и Clostridiales также присутствовали, но их относительная численность составляла менее 3% всех бактериальных последовательностей. Следует отметить, что 3% бактериальных последовательностей, обнаруженных в рубце контрольных ягнят, не могут быть отнесены таксономически ни к какому уровню, а 72 OTU могут быть отнесены только к семейному уровню.

РИСУНОК 1. Относительная численность родов (A) бактерий и (B) архей в рубце ягнят, получавших стандартную баранью муку (контрольная группа), ягнят, получавших льняное масло в течение 16 недель (группа L), и ягнят кормили льняным маслом только перед отъемом (группа LP).

Только семь родов архей были идентифицированы в рубце ягнят в контрольной группе (без добавления льняного семени). Из них Methanobrevibacter были, безусловно, наиболее многочисленным родом, за которым следовали Methanosphaera (рис. 1B). Только на эти два рода приходилось 99,35% всех последовательностей архей, идентифицированных во всех образцах в этой экспериментальной группе. Остальные последовательности были отнесены к Methanosarcina , Methanomassiliicoccus , неклассифицированному Thermoplasmata , неклассифицированному Euryarchaeota и неклассифицированному Nitrososphaera.

Влияние добавок льняного масла на микробиом рубца

Prevotella (27,48%), неклассифицированные Gammaproteobacteria (23,16%), неклассифицированные Veillonellaceae (9,97%) и неклассифицированные Lachnospiraceae (6,57%) также доминировали в рубце ягнят с добавлением льняного масла исследование (L) (рис. 1А). Ординация n-MDS показала, что бактериальные сообщества у этих ягнят (L), по-видимому, группировались вместе (рис. 2A), и анализ PERMANOVA подтвердил, что они были значительными ( p = 0.033) различия в структуре бактериального сообщества рубца этих животных по сравнению с контрольными животными.

РИСУНОК 2. График неметрического многомерного масштабирования (nMDS) рубца (A) структур сообщества бактерий и (B) структур сообщества архей на уровне рода. Ягнята контрольной группы (C) обозначены символом aaa, ягнята, которых кормили льняным маслом в течение 16 недель (L), обозначены символом bbb, а ягнята, которых кормили только льняным маслом перед отъемом (L-P), обозначены символом aaadown.

Анализ процента сходства

(SIMPER) показал, что основными причинами различий в структурах бактериального сообщества между ягнятами, которых кормили льняным рационом, и теми, которых кормили контрольным рационом, были Succinivibrio , неклассифицированные Gammaproteobacteriaceae, Selenomonas , неклассифицированные Veillonellaceae, Dialister, Bifidobacterium , неклассифицированные Prevotellaceae, Roseburia, Ruminococcus , неклассифицированные Erysipelotrichaceae, Erysipelotrichaceae_incertae_sedis и неклассифицированные Firmicutes (таблица 1). Вместе эти роды бактерий объясняют 21,16% различий в структурах бактериальных сообществ.

ТАБЛИЦА 1. Анализ процентного сходства (SIMPER) родов бактерий, учитывающий 21,16% различий, рассчитанных между структурами сообщества рубца групп C (контрольная группа) и L (группа, получавшая добавку льняного масла на протяжении 16 недель).

Также наблюдалось четкое скопление сообществ архей у контрольных ягнят от ягнят, получавших корм с добавлением льняного семени (рис. 2B), и PERMANOVA подтвердила, что эти сообщества значительно различались, и эта разница была наиболее выражена на уровне рода ( p = 0.005). Хотя те же два рода архей, Methanobrevibacter и Methanosphaera , доминировали в рубце ягнят, получавших добавку, относительное обилие этих родов значительно отличалось ( p = 0,005) от ягнят, не получавших добавку. Относительная численность Methanobrevibacter составила 58,75% у ягнят, получавших льняное семя, по сравнению с 73% у тех, кто не получал. Напротив, относительная численность Methanosphaera была значительно выше у животных, получавших добавку, по сравнению с животными, не получавшими добавки (40.82 и 26,67% соответственно).

Не наблюдалось существенных различий в концентрациях пропионовой, масляной или уксусной кислоты, вырабатываемой ягнятами, которых кормили стандартным кормом, и ягнятами, получавшими добавки с льняным маслом (рис. 3).

РИСУНОК 3. Концентрация летучих жирных кислот (ЛЖК), измеренная через 16 недель в рубце ягнят на контрольном рационе (C), ягнятах, получавших льняное масло в течение 16 недель (L), и ягнятах, получавших только льняное масло перед отъемом (LP)- (A) пропионовая кислота, (B) масляная кислота, (C) уксусная кислота, (D) отношение уксусной плюс масляной кислоты к пропионовой кислоте.

Стойкий эффект пищевой добавки в раннем возрасте

Структура бактериального сообщества рубца ягнят, получавших только льняное масло на этапе перед отъемом (L-P), также значительно ( p = 0,015) отличалась от контрольной группы (рис. 2А). Анализ SIMPER показал, что 14 родов бактерий, включая Succinivibrio, Bifidobacterium , Dialister, Lachnospiraceae_incertae_sedis и неклассифицированные Gammaproteobacteria , были ответственны за 21.28% несходства (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. Анализ процентного сходства (SIMPER) бактериальных семейств, на который приходится 21,28% различий, рассчитанных между структурами сообщества рубца групп C (контрольная группа) и LP (группа, получающая льняное масло только перед отъемом) через 16 недель .

Хотя в группе, получавшей льняное масло перед отъемом (группа LP) (таблица 3B), оказалось, что разнообразие видов архей увеличилось, структура сообщества была незначительной ( p = 0.12) отличается от контрольной группы. Не было зарегистрировано существенных различий в концентрациях ЛЖК между группой LP и контрольной группой (рис. 3).

ТАБЛИЦА 3. Видовое богатство (d), видовая выравненность (J′) и шенноновское разнообразие [H′(loge)] сообществ в рубце ягнят на контрольном рационе (Контроль), ягнятах, получавших льняное масло в течение 16 недель (группа L) и ягнят, которых кормили только льняным маслом перед отъемом (группа LP) — (A) бактериальных сообществ, (B) архейных сообществ.

Различия в эффекте краткосрочного и долгосрочного приема пищевых добавок

Сравнение ягнят, получавших корм с добавлением льняного масла в течение ~14 недель (группа L), и ягнят, получавших только льняное масло перед отъемом (~4 недели; группа LP), выявило значительные ( p = 0,003) различия между бактериальными сообществами их рубца. . Четкое скопление бактериальных сообществ в этих двух группах ягнят можно увидеть на графике nMDS (рис. 2А), а видовое разнообразие бактерий было выше ( p = 0.02) в группе, которая получала льняное масло только в период до отъема, по сравнению с группой, которая получала его на протяжении всего периода (таблица 3А). Кроме того, были обнаружены некоторые различия в концентрациях ЛЖК между этими двумя группами ягнят с тенденцией к увеличению пропионата и снижению содержания бутирата у животных, получавших добавку только перед отъемом ( p = 0,16 и p = 0,083, соответственно). ). Однако никаких существенных различий в разнообразии архей (таблица 3B) или структуре сообщества ( p = 0. 99 и 0,29 соответственно).

Ассоциации между бактериями рубца и ЛЖК

Коэффициент корреляции Пирсона (r) использовался для определения того, можно ли наблюдать какие-либо значимые корреляции между профилями ЛЖК в рубце ягнят, получавших разные рационы, и любым из десяти наиболее распространенных родов бактерий (рис. 4). У ягнят, получавших корм без добавок в течение всего периода исследования (контроль), все доминирующие роды, кроме неклассифицированного Prevotellaceae , положительно коррелировали с пропионовой кислотой.Неклассифицированные Prevotellaceae положительно коррелировали с уксусной и масляной кислотой ( r = 0,15 и 0,75 соответственно), в то время как другие распространенные роды не имели корреляции или имели отрицательную корреляцию с этими двумя ЛЖК.

РИСУНОК 4. Тепловые карты, показывающие корреляцию между относительной численностью последовательностей, отнесенных к каждому роду бактерий, и концентрациями ЛЖК (уксусной, масляной и пропионовой) в рубце ягнят, получавших контрольный рацион (С), ягнят, получавших льняное масло перед только отъем (LP) и ягнят кормили льняным маслом в течение 16 недель (L). Приведены коэффициенты корреляции Пирсона (r), где r < 0 указывает на отрицательную корреляцию (красный), r = 0 указывает на отсутствие корреляции (белый) и r > 0 указывает на положительную корреляцию (зеленый).

Аналогичная картина наблюдалась у ягнят, получавших рацион с добавлением льняного масла только в период перед отъемом (группа LP), при этом относительно наиболее распространенные роды бактерий положительно коррелировали с пропионовой кислотой, за одним исключением, неклассифицированным Firmicutes ( г = -0.1). Однако, в отличие от контрольной группы, многие из этих родов также положительно коррелировали с масляной кислотой. Как и в контрольной группе, большинство из них отрицательно коррелировали с уксусной кислотой.

Другой профиль наблюдался у ягнят, получавших корм с добавками в течение всего периода исследования (группа L). У этих ягнят было меньше бактериальных последовательностей, положительно коррелирующих с пропионовой кислотой и отрицательно коррелирующих с уксусной кислотой. Хотя четыре из наиболее распространенных последовательностей положительно коррелировали с пропионовой кислотой, эта корреляция была слабой.Относительная численность Prevotella, Succinivibrio и неклассифицированного рода Veillonellaceae отрицательно коррелировала с концентрациями пропионовой кислоты ( r = -0,33, -0,49 и -0,28 соответственно). Относительные в изобилии сукцинивибрио и неклассионные Veellonellaceae были положительно коррелированы с уксусной кислотой ( R = 0,79 и 0,47, соответственно), в то время как сукциникластики, Prevotella и неклассифицированные GammaProteobacteria были положительно коррелированы с бутириной кислотой ( г = 0.41, 0,25 и 0,35 соответственно).

Обсуждение

Добавление льняного масла в рационы жвачных животных было предложено в качестве потенциального средства сокращения выбросов метана (Machmüller et al., 1998; Rowntree et al., 2010). Метаногенам в рубце требуется водород, синтезируемый бактериями и простейшими во время микробной ферментации корма, для производства CH ₄ . Поэтому было высказано предположение, что водород является ограничивающим фактором в производстве CH ₄ , а снижение доступности H ₂ может привести к снижению выхода CH ₄ .Хотя точный механизм, с помощью которого добавки с льняным маслом подавляют выработку CH ₄ , неизвестен, сообщалось, что добавка может снижать количество H ₂ , доступного для метаногенов в рубце, посредством токсического воздействия на бактериальные и протозойные H. ₂ продуцентов в рубце (Morgavi et al., 2010) и при биогидрировании полиненасыщенных жирных кислот в масле (Czerkawski, 1986). Однако на сегодняшний день какие-либо положительные эффекты, наблюдаемые у взрослых животных, не сохраняются после прекращения диетического вмешательства (Yáñez-Ruiz et al., 2015). В текущем исследовании изучалось влияние добавок льняного масла на микробиом ягнят в раннем возрасте, чтобы определить, оказывало ли это диетическое вмешательство какое-либо влияние на структуру микробного сообщества рубца во время колонизации рубца, и варьировался ли этот эффект в зависимости от того, как долго продолжалось вмешательство. Одна из проблем, связанных с любой пищевой добавкой, заключается в том, оказывает ли она неблагоприятное воздействие на животное. Льняное масло не оказало отрицательного влияния на ежедневный прирост веса или среднесуточное потребление ягнят в текущем исследовании.

Структура микробиома рубца ягнят в раннем возрасте

Как и в других отчетах (Stevenson and Weimer, 2007; Lee et al., 2012; Henderson et al., 2015; Lopes et al., 2016), Prevotella был наиболее многочисленным родом в рубце ягнят, которых кормили стандартная мука из баранины, на которую приходится почти треть всех присутствующих бактериальных последовательностей. Этот род считается частью основного сообщества бактерий рубца и играет важную роль в разложении органических веществ (Henderson et al., 2015). Основываясь на физиологии культивируемых представителей этого рода, Prevotella spp. считаются производителями пропионата и сукцината (Bryant and Small, 1956; Strobel, 1992). Неклассифицированные роды Gammaproteobacteria также имели высокую относительную численность в рубце ягнят; об этом открытии также сообщили Wang et al. (2017). Неклассифицированные Lachnospiraceae , семейство, положительно коррелирующее с общей эффективностью корма (Jewell et al., 2015), также присутствовали при высокой относительной численности.Аналогичным образом, Veillonellaceae , еще одно семейство с относительно высокой численностью у ягнят, получавших корм без добавок, были идентифицированы как связанные с приростом бактерии в рубце бычков (Myer et al., 2015), хотя Li and Guan (2017) сообщили, что представители этого семейства были связаны с низкой эффективностью корма. Известно, что семейство Veillonellaceae производит пропионат в качестве основного продукта ферментации (Myer et al., 2015). Prevotellaceae, Gammaproteobacteria, Lachnospiraceae и Veillonellaceae также были недавно идентифицированы как часть основного микробиома рубца крупного рогатого скота (Li and Guan, 2017).

Большое количество неклассифицированных последовательностей, обнаруженных в этом исследовании, также было сообщено другими группами (Creevey et al. , 2014; Liu et al., 2016), и это неудивительно, учитывая большой процент рубцовых бактерий, которые все еще остаются некультивируемыми. Создание эталонного набора последовательностей микробного генома рубца с помощью таких инициатив, как Hungate 1000, должно способствовать более точной классификации в будущем (Creevey et al., 2014).

Влияние льняного масла на структуру микробного сообщества и профили ЛЖК

Включение льняного масла в рацион ягнят в течение примерно 14 недель значительно изменило структуру сообщества бактерий и архей в рубце.Аналогичные результаты были получены Lillis et al. (2011), когда они проанализировали бактериальные сообщества рубца взрослого крупного рогатого скота, получавшего диету с добавлением соевого масла, и тех, кто не кормился. Соевое масло, как и льняное масло, содержит полиненасыщенные жирные кислоты и, как было показано, также снижает выбросы кишечного метана при включении в рацион жвачных животных (Petrie et al., 2010). Одним из главных факторов несходства в бактериальных сообществах между контрольными ягнятами и теми, которых кормили льняным маслом (группа L) в текущем исследовании, было семейство бактерий, продуцирующих сукцинат (Russell and Rychlik, 2001), Succinivibrionaceae , которое имело более высокую относительную обилие в группе L. Предыдущее исследование таммарских валлаби также сообщило о высокой относительной численности Succinivibrionaceae в передних отделах кишечника валлаби, и было высказано предположение, что это является важным фактором, способствующим низким выбросам кишечного метана животными (Pope et al., 2011). Veillonellaceae , которые, как известно, связаны с производством пропионата (Reichardt et al., 2014; Lecomte et al., 2015; Myer et al., 2015), присутствовали в более высокой относительной численности в группе L, в то время как Ruminococcaceae , семейство, связанное с более высокими излучателями CH ₄ (Kittelmann et al., 2014), присутствовала в более низкой относительной численности в группе L по сравнению с контрольной группой. Сообщалось о более высокой относительной численности Veillonellaceae в рубце крупного рогатого скота с низким уровнем выбросов метана (Wallace et al., 2015). Льняное масло подавляло относительную численность Erysipelotrichaceae , семейства, обычно обнаруживаемого в рубце овец. Эти результаты показывают, что более низкие уровни производства метана, связанные с диетами, дополненными льняным маслом, зарегистрированные в предыдущих исследованиях, могут быть связаны с избирательным продвижением и подавлением определенных семейств бактерий.

Хотя структура сообщества архей значительно различалась у ягнят, которых кормили льняным маслом (L), и в контрольной группе, одни и те же два метаногена, Methanobrevibacter и Methanosphaera , доминировали в обоих сообществах, хотя их относительная численность отличалась между группами, при этом Methanosphaera относительно больше в рубце группы L. Эти два рода различаются по субстратной специфичности; Methanosphaera , виды, используют CO ₂ , H ₂ и формиат, а Methanobrevibacter spp., используйте CO ₂ , H ₂ и метанол (Liu and Whitman, 2008; Zhou et al., 2010). Таким образом, различия в их относительной численности могут отражать изменения в доступности субстрата. Также могли иметь место значительные различия на уровне видов, которые не были обнаружены в текущем исследовании, поскольку сообщалось, что определенные субстраты благоприятствуют определенным видам метаногенов, которые часто имеют узкий диапазон субстратов (Danielsson et al., 2014; Henderson et al. , 2015). Кроме того, ранее сообщалось о различиях в метаногенезе на уровне видов (Danielsson et al., 2017). Хотя метаногены являются единственными производителями метана в рубце, они зависят от субстратов, а именно H ₂ и CO ₂ , предоставляемых бактериями и простейшими видами для размножения и производства CH ₄ (Hook et al., 2010). ). Таким образом, изменения в других микробных сообществах рубца повлияют на метаногены. Действительно, бактерии, продуцирующие ацетат и водород, связаны с более высоким содержанием метаногена в рубце, в то время как продуценты пропионата и сукцината коррелируют с более низким содержанием метаногена (Van Nevel and Demeyer, 1996; Knapp et al. , 2014).

Концентрации летучих жирных кислот были одинаковыми у ягнят контрольной группы и ягнят, получавших льняное семя, несмотря на эти значительные изменения в структуре микробного сообщества. Как и другие микробиомы, микробиом рубца содержит высокий уровень избыточности (Weimer, 2015), что может объяснить, почему различия в бактериальном и архейном разнообразии и бактериальных корреляционных профилях ЛЖК не влияли на концентрацию/профиль ЛЖК.

Влияние льняного масла только на этапе перед отъемом

Ягнята в группе L-P получали льняное масло только на этапе перед отъемом и возвращались к контрольному рациону после отъема.Несмотря на то, что они находились на одной и той же диете в течение примерно 10 недель до отбора проб, структура бактериального сообщества рубца ягнят в группе LP значительно отличалась от тех, которые никогда не получали льняного масла (контрольная группа), и, таким образом, не вернулась к структуре, аналогичной в контрольную группу после прекращения приема добавок. Это интересный результат, поскольку манипуляции с микробиомом рубца в более позднем возрасте обычно длятся от нескольких дней до недель, и это объясняется избыточностью и устойчивостью микробиома рубца (Hart et al., 2008; Веймер, 2015). Были и другие сообщения о ярко выраженных и длительных эффектах питания в раннем возрасте (Distel et al., 1994; Yáñez-Ruiz et al., 2015). Оба Yáñez-Ruiz et al. (2010) и Abecia et al. (2014b) сообщили о постоянно измененных микробиомах и возможном микробном программировании в раннем возрасте с помощью диет, дополненных BMC. Было показано, что первичные колонизаторы кишечника влияют на последовательных колонизаторов (Chaucheyras-Durand and Fonty, 2002; Danzeisen et al., 2013), и, таким образом, диета в раннем возрасте может оказывать влияние, влияя на первичных колонизаторов, которые важны для определения состава зрелого микробиома. .

Даже когда ягнята получали только льняное масло на этапе перед отъемом, большая часть различий, наблюдаемых в структуре бактериального сообщества по сравнению с контрольной группой, снова была связана с Succinivibrionaceae , которых было относительно больше в группе L-P. Аналогичным образом, Veillonellaceae были относительно более распространены в группе LP по сравнению с контрольной группой, тогда как семейство Ruminococcaceae было относительно более распространено в контрольных ягнятах.

Spirochaetaceae , семейство бактерий, обычно обнаруживаемое в рубце (Bekele et al., 2011), имело более высокую относительную численность в контрольной группе, чем у животных, получавших добавку в период перед отъемом. Fibrobacter и Sharpea , обнаруженные Kittelmann et al. (2014) было обнаружено, что в контрольной группе в текущем исследовании их было относительно больше, чем в любой группе ягнят, получавших дополнительный рацион до отъема или в течение всего периода.В целом эти результаты могут указывать на то, что микробиом ягнят, которых кормили льняным семенем, с большей вероятностью связан с уменьшением выбросов метана.

Bifidobacteriaceae , которые, как сообщается, приносят многочисленные преимущества для здоровья хозяина, включая регуляцию кишечного микробного гомеостаза, ингибирование патогенов, модуляцию местных или системных иммунных реакций, выработку витаминов и биоконверсию пищевых компонентов в биологически активные соединения (Mayo and Van Sinderen, 2010) присутствовали в очень низкой относительной численности (0. 06%) в бактериальных сообществах у контрольных ягнят по сравнению с обеими группами ягнят, получавших льняное масло, даже с теми, которые получали его только перед отъемом. Это может иметь большое значение для долгосрочного здоровья групп, получающих льняное масло.

Еще раз, несмотря на влияние льняного масла на структуру микробного сообщества и различия в профилях корреляции ЛЖК, не наблюдалось различий в профилях ЛЖК у ягнят Л-П и контрольной группы, что еще раз позволяет предположить, что общее брожение не было затронуто.Эти результаты свидетельствуют о том, что диетическое лечение в раннем возрасте может вызывать изменения в микробиоме, которые сохраняются даже после изменения диеты, предполагая, что может существовать окно возможностей, когда можно манипулировать микробными сообществами, чтобы способствовать улучшению здоровья и / или производственных характеристик. Однако различия, наблюдаемые в микробном составе ягнят, получавших льняное семя только перед отъемом, и тех, кто получал его в течение всего периода, позволяют предположить, что влияние добавки на микробиом может быть менее предсказуемым, чем хотелось бы.

Эффекты краткосрочного и долгосрочного приема добавок

Хотя структура сообщества архей рубца была сходной у ягнят, получавших льняное масло на протяжении всего исследования (L), и у ягнят, получавших добавку только перед отъемом (L-P), между этими группами наблюдались значительные различия в структурах бактериального сообщества. Это подчеркивает сложность прогнозирования результатов вмешательств в такие сложные микробные сети. Одним из возможных объяснений различий в профилях бактериальных сообществ между двумя группами является влияние второго нарушения в виде изменения рациона во время критической вехи (отъема от груди) на микробные сообщества.Множественные стрессоры могут комбинироваться по-разному, давая общий эффект, который может быть равен сумме стрессоров (аддитивность), равен эффекту наиболее пагубного воздействия (простой сравнительный), больше (синергический) или меньший (антагонистический). сумма индивидуальных возмущений. Это затрудняет прогнозирование последствий множественных возмущений (Folt et al. , 1999; O’Gorman et al., 2012; Vye et al., 2015). Возможно, что введение дополнительных нарушений во время микробной колонизации рубца в раннем возрасте привело к большему стрессу для микроорганизмов и, следовательно, в целом к ​​большему влиянию на структуру микробного сообщества.Если диетическое лечение продолжалось до отъема (в течение дополнительных 2 недель), микробные профили ягнят, которых кормили льняным маслом на протяжении всего исследования, и ягнят, получавших льняное масло кратковременно, могли быть более схожими.

Несмотря на то, что это не было значительным, все же наблюдалась тенденция к более высокому уровню пропионата и более низкому уровню бутирата у ягнят в группе LP по сравнению с теми, кто получал льняное масло (группа L). Это может иметь значение в долгосрочной перспективе для производства метана. Высокие концентрации бутирата в рубце положительно коррелируют с высокими выбросами метана, в то время как концентрации пропионата отрицательно коррелируют с выбросами метана (Hungate, 1996; Lana et al. , 1998; Рассел, 1998 г.; Мохаммед и др., 2011). Тот факт, что относительное обилие трех доминирующих бактерий ( Prevotella, Succinivibrio и неклассифицированных Veillonellaceae ) отрицательно коррелировало с концентрацией пропионата у ягнят в группе L, но положительно коррелировало с этой ЛЖК у ягнят, получавших корм. только во время до отъема, предполагает, что либо в двух экспериментальных группах происходили разные процессы, либо эти процессы опосредовали разные бактерии.Было бы интересно сравнить уровни выделения метана у ягнят, получавших льняное масло в течение короткого периода времени, с теми, которые продолжали получать льняное масло на протяжении всего исследования, чтобы увидеть, транслируются ли микробные изменения, достигнутые в результате краткосрочного введения добавок, в постоянное снижение выбросов метана после того, как добавки прекратились. прекратился.

Заключение

В заключение, добавление в рацион ягнят льняного масла оказало значительное влияние на структуру как бактериального, так и архейного сообщества в рубце. Кроме того, в раннем возрасте кратковременное добавление в рацион ягнят льняного масла привело к долговременным изменениям в структуре бактериального сообщества рубца. Эти данные подчеркивают важность питания в раннем возрасте для формирования состава зрелого микробиома. Однако структура микробного сообщества в рубце ягнят, получавших льняное масло кратковременно, и ягнят, получавших льняное масло на протяжении всего исследования, различалась, что указывает на то, что последствия изменений и нарушений в рубце по мере формирования микробиома в раннем возрасте трудно предсказать. .Это исследование дает представление о влиянии диетических вмешательств в раннем возрасте на микробиом рубца и может помочь в разработке стратегий повышения эффективности кормления, улучшения здоровья хозяина или снижения выбросов метана за счет манипуляций с микробиомом.

Вклад авторов

TL — доктор философии. студентка, взявшая на себя всю лабораторную работу по микробиому. ТБ является ИП по исследованиям на животных и постановке эксперимента. ED является ведущим специалистом по исследованиям микробиома и внес свой вклад в разработку, анализ данных и написание статьи.С.С. является постдокторантом в лаборатории микробиологии и занимался всеми аспектами микробиологии, но особенно статистическим анализом.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась в рамках программы JPI FACCE (проект RumenStability) и Инициативы по исследованию парниковых газов Министерства сельского хозяйства Ирландии, рыболовства и морского судоходства для Ирландии (проект №.10/RD/GHG-IRELAND/716).

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.01656/full#supplementary-material

.

РИСУНОК S1 | Среднесуточное потребление корма и прирост веса (ADG) от рождения до отъема для ягнят на контрольном рационе (C), ягнят, получавших льняное масло в течение 16 недель (L), и ягнят, получавших только льняное масло перед отъемом (LP ).

ТАБЛИЦА S1 | Полный список типов, присвоенных последовательностям, полученным в результате секвенирования ДНК, извлеченной из образцов рубца ягнят в контрольной группе (необработанных).

Сноски

1. arb-silva.de/silva-license-information

Ссылки

Абесия Л., Рамос-Моралес Э., Мартинес-Фернандес Г., Арко А., Мартин-Гарсия А. И. и Ньюболд С. Дж. (2014a). Управление кормлением в раннем возрасте влияет на микробную колонизацию и ферментацию в рубце новорожденных козлят. Аним. Произв. науч. 54, 1449–1454. дои: 10.1071/AN14337

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Абесия, Л., Waddams, K.E., Martinez-Fernandez, G., Martin-Garcia, A. I., Ramos-Morales, E., Newbold, C.J., et al. (2014б). Антиметаногенное пищевое вмешательство в раннем возрасте жвачных животных изменяет колонизацию рубца археями. Археи 2014:841463. дои: 10.1155/2014/841463

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Андерсон Л.П., Патерсон Дж.А., Ансотеги Р.П., Чекава М. и Шмутц В. (2001). Влияние потребления разлагаемого и неразлагаемого протеина на продуктивность лактирующих первотелок J.Аним . науч. 79, 2224–2232. дои: 10.2527/2001.7982224x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Бекеле А. З., Койке С. и Кобаяши Ю. (2011). Филогенетическое разнообразие и диетическая ассоциация трепонемы рубца выявлены с помощью группового анализа на основе генов 16S рРНК. FEMS Microbiol . Письмо. 316, 51–60. doi: 10.1111/j.1574-6968.2010.02191.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Боади, Д. , Benchaar, C., Chiquette, J. и Massé, D. (2004). Стратегии смягчения последствий для сокращения выбросов кишечного метана от молочных коров: обновленный обзор. Кан. Дж. Аним. науч. 84, 319–335. дои: 10.4141/A03-109

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Бутс, Б., Лиллис, Л., Клипсон, Н., Петри, К., Кенни, Д.А., Боланд, Т.М., и др. (2013). Реакция разнообразия анаэробных грибов рубца (филум Neocallimastigomycota) на изменения в рационе крупного рогатого скота. Дж . Заяв.микробиол. 114, 626–635. doi: 10.1111/jam.12067

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Брайант, член парламента, и Смолл, Н. (1956). Характеристика двух новых родов анаэробных изогнутых палочек, выделенных из рубца крупного рогатого скота. Дж . Бактериол. 72, 22–26.

Академия Google

Каро, Д., Кебреаб, Э., и Митлоэнер, Ф. М. (2016). Снижение выбросов кишечного метана от глобальных систем животноводства с помощью стратегий питания. Клим. Изменение 137, 467–480. doi: 10.1007/s10584-016-1686-1

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чаушейрас-Дюран, Ф., и Фонти, Г. (2002). Влияние пробиотических дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1077) на микробную колонизацию и ферментацию в рубце новорожденных ягнят. Микроб. Экол. Здоровье Дис. 14, 30–36. дои: 10.1080/08